这项研究由来自亚利桑那州立大学（Arizona State University）生物设计研究所进化机制中心（Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute）的 Stephan Baehr 等人完成，论文于 2025 年 3 月 15 日在《Genome Biology and Evolution》期刊上在线发表。这是一项关于突变积累（mutation-accumulation, MA）实验方法学的原创性研究，旨在评估以液体连续稀释（serial dilution）方式进行的 MA 实验是否能够作为传统琼脂平板（agar plate）MA 实验的有效替代方案。

从学术背景来看，MA 实验是进化生物学中用于直接测量自发突变率（mutation rate）和突变谱（mutation spectrum）的金标准方法。然而，传统 MA 实验通常依赖微生物在琼脂平板上形成菌落并反复划线（streaking），这一过程不仅劳动密集，而且平板环境被认为可能引入人为选择（artificial selection）或与真实生长环境存在较大差异。此外，许多微生物难以在平板上生长，这限制了 MA 实验的适用范围。因此，本研究旨在验证一种完全液相（liquid-phase）的 MA 实验方案，该方案通过连续稀释实现单细胞瓶颈（single-cell bottleneck），从而减少研究者操作偏差，并且原则上更易于自动化。研究选择了一种错配修复缺陷（mismatch-repair deficient, MMR-）的 Escherichia coli K12 MG1655 菌株作为模式生物，因为该菌株已在先前的 MA 实验中被多次表征，且具有较高的突变率，便于在较短时间内获取足够多的突变事件。

在实验流程方面，该研究从同一单菌落出发，同时启动了液相 MA 和平板 MA 两组平行的实验，持续 20 天。平板 MA 组包含 40 个初始克隆，按照标准方法每天挑选单个菌落并划线至新的 LB 琼脂平板。液相 MA 组则从同一祖先培养物中取 16 个样本，每个样本在 96 深孔板（96-deepwell plate）中进行连续稀释，稀释程度设置为使部分孔出现混浊生长而部分孔保持澄清，从而确保生长来源于单个可存活细胞。每次转移时，研究者选择稀释倍数最高且出现混浊生长的孔用于下一轮稀释，以此维持单细胞瓶颈。经过 20 天的突变积累后，对所有品系的基因组 DNA 进行提取，并利用高通量测序（high-throughput sequencing）获得全基因组序列。序列分析流程包括使用 FastQC 进行质量控制、Trimmomatic 去除接头序列、BWA 将读数比对至 E. coli K12 参考基因组、GATK2 调用突变、SnpEff 注释突变以计算非同义突变与同义突变比值（dN/dS）以及基因间区（intergenic）与基因内区（intragenic）突变分布。细胞分裂次数的估计通过菌落形成单位（colony-forming units, CFU）计数来完成：平板 MA 组通过重悬 20 天后的菌落并稀释涂板计数，液相 MA 组则通过将冷冻保存的培养物重新接种、稀释至单细胞瓶颈后再培养并计数 CFU。此外，研究还通过 96 孔板读数器（plate reader）测量光密度（OD600）变化来评估品系的相对适应度（fitness）和承载能力（carrying capacity）。

研究结果显示，液相 MA 与平板 MA 在突变率估计上高度一致。液相 MA 的碱基替换（base-pair substitution, BPS）突变率为每世代每碱基位点 2.80 × 10⁻⁸，平板 MA 为 3.10 × 10⁻⁸，两者差异较小，且与先前文献中报道的 MMR- E. coli 突变率相符。液相 MA 品系平均每世代经历 29.9 次细胞分裂，而平板 MA 为 26.9 次，这一差异源于液相培养物在 1 mL 体积中支持了更多的细胞分裂。两组实验的插入缺失（indel）突变率均低于碱基替换突变率，这与先前研究一致。在突变谱方面，统计检验显示液相与平板条件之间存在显著差异，主要表现为液相 MA 中 A:T→G:C 转换（transition）增加而 G:C→A:T 转换减少，转换偏差（transition skew）达到 4.7:1。这种偏差可能反映了碱基互变异构化（tautomerization）在突变产生中的作用。尽管突变谱存在统计学差异，但总体突变率并未受到生长介质（液相或平板）的显著影响。

在突变积累过程中，研究还检测到了选择（selection）的存在。根据中性预期，E. coli MG1655 中编码区与非编码区突变的比例应为 5.74:1，但液相 MA 中插入缺失的基因间区与基因内区比例为 2.68:1，平板 MA 为 2.54:1，表明编码区插入缺失受到纯化选择（purifying selection）的抑制。对于碱基替换，液相和平板 MA 的基因内区与基因间区比例分别为 9.91:1 和 7.71:1，显示出编码区碱基替换的相对富集。在编码区内，非同义突变与同义突变的比值在液相 MA 中为 2.13，平板 MA 中为 2.07，均显著低于中性预期比值 3.10，提示存在针对非同义突变的纯化选择。上述选择效应的强度与文献报道一致，说明即便在单细胞瓶颈条件下，MA 实验仍可能受到一定程度的选择偏倚影响。

本研究的主要结论是，液相 MA 实验在突变率估计、适应度下降趋势以及选择强度方面与平板 MA 基本等价，从而支持了传统平板 MA 实验所得突变率估计具有广泛适用性的观点。液相 MA 的一个明显优势在于其每日细胞分裂次数的变异较小，这有助于提高突变率估计的精确性。更重要的是，液相 MA 方案天然适用于液体处理机器人（liquid handling robot）的自动化，这有望显著降低 MA 实验的人力成本，并扩大 MA 实验在难以平板培养的微生物中的应用前景。此外，研究观察到 MMR- E. coli 突变谱中 A:T→G:C 转换的偏倚，这一发现与 Watson-Crick 提出的碱基互变异构化机制相吻合，提示低频的互变异构化事件可能在生物体中具有真实且不可忽视的突变贡献。研究还指出，由于选择可能使非同义突变被低估，MMR- E. coli 的真实突变率可能比现有估计高出约三分之一，达到约 3.8 × 10⁻⁸ 每碱基位点每世代。

本研究的亮点在于首次系统比较了同一菌株在液相和平板 MA 条件下的突变率与突变谱，并证明了液相 MA 的可行性。方法学上，连续稀释实现单细胞瓶颈的操作虽然比平板划线更耗时，但其自动化潜力和对平板难培养微生物的适用性具有明显优势。此外，研究通过对突变谱的精细分析，为碱基互变异构化作为自发突变机制之一提供了新的实验证据，这对于验证新型测序技术检测 DNA 突变的能力也具有参考价值。总体而言，这项研究在方法学上为突变率测量提供了一种新的选择，同时增强了对传统 MA 实验结果的信心。