本研究的主要作者为Teresa Merino-Ramos、Nereida Jiménez de Oya、Juan-Carlos Saiz和Miguel A. Martín-Acebes，他们均来自西班牙国家农业与食品研究与技术研究所（Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, INIA）生物技术系。该研究于2017年5月15日在线发表于《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》期刊。

一、研究背景与目的

黄病毒属（flavivirus）是一类正链RNA病毒，在全球范围内广泛分布，每年感染数百万人，但至今尚无获批的特异性抗病毒药物。其中，西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）是一种通过蚊虫传播的黄病毒，可引起脑膜炎和脑炎暴发。另一种近年来备受关注的蚊媒黄病毒——寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）因导致新生儿小头畸形（microcephaly）和格林-巴利综合征（Guillain-Barré syndrome）等神经系统疾病而成为全球公共卫生威胁。与WNV一样，针对ZIKV也缺乏获批的特效药物和疫苗。

已有研究表明，去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid, NDGA）能够抑制相关黄病毒——登革病毒（dengue virus, DENV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）的复制。NDGA是一种酚类化合物，是沙漠灌木拉雷亚三齿拉雷亚（Larrea tridentata）的主要代谢产物。值得关注的是，NDGA的合成甲基化衍生物——四-O-甲基去甲二氢愈创木酸（tetra-O-methyl nordihydroguaiaretic acid, M4N，又称terameprocol或EM-1421）已在晚期癌症患者中开展I/II期临床试验，但其对黄病毒的抗病毒潜力尚未被评估。由于黄病毒的复制高度依赖宿主细胞的脂质代谢，而NDGA此前已被证实可通过干扰甾醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding proteins, SREBP）通路来扰乱脂质代谢，因此本研究的目的在于评估NDGA及其衍生物M4N对WNV和ZIKV感染的影响，并探讨SREBP通路作为抗黄病毒药物靶标的可行性。

二、研究流程与实验方法

研究采用了多项实验方法系统地评估了NDGA和M4N的抗病毒活性及其作用机制。

首先，研究者以非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）为细胞模型，分别用WNV谱系1的高神经毒力毒株NY99（MOI为1 PFU/细胞）和谱系2的SRB-Novi Sad/12毒株感染细胞。在感染后1小时，向培养液中加入浓度为10 μM或35 μM的NDGA或M4N，24小时后通过空斑试验测定病毒产量。同时，通过检测细胞ATP含量评估药物的细胞毒性。

为判断药物是否具有直接灭活病毒的作用，研究者以约1.5×10⁹ PFU的WNV与药物在37℃共孵育1小时，然后测定剩余感染性。

为确定药物影响病毒感染的具体阶段，研究者在Vero细胞感染WNV后加入药物，24小时后分别用定量RT-PCR检测培养上清中病毒基因组的释放量以及细胞中病毒RNA的含量。同时，利用抗双链RNA（dsRNA）抗体进行免疫荧光染色，观察病毒复制中间体的积累情况；通过Western blot检测细胞内病毒包膜糖蛋白E的表达水平。此外，研究者还采用了稳定表达WNV结构蛋白并持续分泌重组亚病毒颗粒（recombinant subviral particles, RSPs）的HeLa3-WNV细胞系，评估药物对病毒形态发生和颗粒释放阶段的影响。该细胞系无需病毒复制过程即可产生亚病毒颗粒，因此可以区分药物是作用于基因组复制阶段还是装配/出芽阶段。

为进一步验证SREBP通路在WNV感染中的作用，研究者选用了三种结构不同的SREBP通路抑制剂——白藜芦醇（resveratrol）、PF-429242和fatostatin，以及一种5-脂氧合酶（5-lipoxygenase, 5-LOX）抑制剂zileuton作为对照药物，在Vero细胞感染WNV后加入药物，检测病毒产量的变化。之后，研究者将NDGA、M4N、PF-429242和fatostatin用于ZIKV PA259459毒株感染的Vero细胞，检验这些药物对ZIKV的抑制作用。

最后，通过测定药物的半数细胞毒性浓度（CC₅₀）和半数抑制浓度（IC₅₀），计算了NDGA和M4N对WNV和ZIKV的选择性指数（selectivity index, SI）。

三、主要研究结果

结果显示，NDGA和M4N对两种WNV毒株均表现出剂量依赖性的病毒产量抑制作用。在10 μM和35 μM浓度下，两种药物均能显著降低WNV NY99和SRB-Novi Sad/12的病毒滴度。细胞ATP检测证实，在这些药物浓度下未观察到明显的细胞毒性，说明病毒产量的降低并非由药物毒性引起。

在病毒灭活实验中，仅35 μM的NDGA对WNV感染性有轻度降低作用，且其降低幅度远低于病毒产量实验中的抑制程度；M4N则完全未表现出直接灭活作用。这表明药物的主要抗病毒机制不是直接作用于病毒颗粒。

定量RT-PCR结果显示，NDGA和M4N均能显著抑制培养上清中含基因组的病毒颗粒释放。更为重要的是，两种药物在35 μM浓度下均显著降低了细胞内病毒RNA的含量，提示病毒基因组复制受到抑制。免疫荧光分析显示，药物处理细胞中dsRNA（黄病毒复制的重要中间体）的信号强度显著降低；其中NDGA和M4N处理组的dsRNA荧光信号较未处理对照组明显减弱。Western blot结果进一步证实，35 μM NDGA将细胞内E蛋白水平降至对照的34%，M4N降至对照的43%。

在RSP释放实验中，NDGA和M4N处理4小时后，上清中RSP的释放量未见减少；而作为阳性对照的分泌抑制剂brefeldin A（BFA）则显著抑制了RSP的释放。这一结果说明两种药物并不作用于病毒形态发生或颗粒出芽阶段。综合以上结果，研究者认为NDGA和M4N主要通过抑制病毒基因组复制来发挥抗WNV作用。

在SREBP通路抑制剂实验中，resveratrol、PF-429242和fatostatin均以剂量依赖性方式显著降低了WNV感染滴度。而5-LOX抑制剂zileuton对病毒产量无显著影响。细胞ATP检测显示，所有药物浓度下细胞活力均超过对照的80%。这些结果表明，WNV感染对SREBP通路抑制敏感，但与5-LOX活性无关。同时，由于SREBP通路抑制剂的抗病毒效果低于NDGA和M4N，研究者推测NDGA和M4N对WNV复制的抑制作用可能还涉及SREBP通路以外的其他机制。

在ZIKV实验中，35 μM的NDGA、M4N、PF-429242和fatostatin均显著降低了ZIKV PA259459的病毒产量，证实这些化合物对ZIKV同样具有抗病毒活性。

选择性指数计算结果显示，NDGA对WNV和ZIKV的CC₅₀为162.1 μM，IC₅₀分别为7.9 μM和9.1 μM，选择性指数分别为20.5和17.8。M4N的CC₅₀为1071.0 μM，约为NDGA的6.6倍；其对WNV和ZIKV的IC₅₀分别为9.3 μM和5.7 μM，选择性指数分别达到115.2和187.9，明显优于NDGA。

四、结论与意义

本研究首次证实NDGA的甲基化衍生物M4N对WNV和ZIKV具有显著的抗病毒活性。两种化合物通过抑制病毒基因组复制发挥作用，而非直接灭活病毒或干扰病毒装配/出芽过程。研究进一步支持SREBP通路可作为抗黄病毒干预的可药用靶标，因为多种结构不同的SREBP通路抑制剂均能抑制WNV和ZIKV的复制。此外，NDGA和M4N的抗病毒效果不依赖于5-LOX活性。

尤为重要的是，M4N因其更低的细胞毒性而显示出远优于NDGA的选择性指数。结合M4N在癌症临床试验中已展现的良好安全记录，该化合物被认为比其前体NDGA更适合作为抗黄病毒候选药物进行进一步开发。本研究为WNV和ZIKV等具有重要医学意义的黄病毒感染提供了新的潜在治疗策略，也为基于宿主脂质代谢调控的抗病毒药物研发提供了实验依据。