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主要作者与发表信息
本研究由Katharina Weinhäupl（法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学结构生物学研究所）、Caroline Lindau（德国弗莱堡大学）等共同完成，通讯作者为Nils Wiedemann（弗莱堡大学）和Paul Schanda（法国IBS研究所）。论文题为《Structural Basis of Membrane Protein Chaperoning Through the Mitochondrial Intermembrane Space》，于2018年11月15日发表在Cell期刊（卷175，页码1365–1379），DOI为10.1016/j.cell.2018.10.039。
学术背景
研究领域：线粒体膜蛋白的转运与折叠机制。
科学问题：线粒体内外膜蛋白（如β-桶状蛋白和α-螺旋载体蛋白）需通过线粒体膜间隙（intermembrane space, IMS）转运至目标膜，但这一过程中分子伴侣（chaperone）如何识别并维持这些蛋白的转运构象尚不明确。
研究目标：解析线粒体TIM（Translocase of Inner Mitochondrial Membrane）分子伴侣系统的结构机制，阐明其如何通过动态结合维持前体蛋白（precursor）的转运活性构象，并揭示突变导致疾病的分子基础。
研究流程与实验方法
1. 复合物重构与结构解析
- 研究对象：TIM9•10六聚体复合物及其与底物（如代谢载体蛋白GGC1、AAC3和VDAC片段）的复合物。
- 方法：
- 体外重组：通过镍柱亲和纯化将未折叠的载体蛋白与TIM9•10结合，形成稳定复合物（图1A）。
- 核磁共振（NMR）：利用甲基标记（ALA/LEU/VAL, ALV）和转移NOE效应（transferred NOE）定位结合位点，发现前体蛋白结合于TIM亚基的疏水裂隙（cleft）（图1C-D）。
- 小角X射线散射（SAXS）：结合分子动力学模拟，揭示复合物呈“串珠状”结构，两个TIM六聚体包裹一个前体蛋白（图7C-E）。
2. 功能验证与突变分析
- 酵母模型：
- 突变设计：针对TIM9/TIM10保守疏水残基（如TIM10的V29、F33）进行单点突变（图3A-C）。
- 表型分析：突变体在非发酵培养基（YP甘油）中生长缺陷或致死，线粒体内膜蛋白（如AAC2、TIM23）稳态水平显著下降（图3D）。
- 体外结合实验：突变体TIM9•10丧失与GGC1的结合能力（图4F）。
3. 动态行为与构象研究
- NMR弛豫分析：
- 微秒-毫秒动态：前体蛋白在结合裂隙中经历快速构象交换（~1.3 ms），通过CPMG弛豫色散实验证实（图6D-E）。
- 圆二色谱（CD）：结合态前体蛋白呈现部分α-螺旋构象，区别于完全折叠或未折叠状态（图6I）。
4. 跨膜转运机制
- 体内导入实验：
- 放射性标记：35S标记的AAC2-DHFR前体在TIM突变体中无法稳定滞留于TOM复合物（图4A-B）。
- β-桶状蛋白组装：TIM突变导致外膜蛋白（如Porin、TOM40）的SAM复合物依赖的组装缺陷（图5A-D）。
主要结果
- 结合位点特征：TIM通过多个钳状疏水位点（如TIM10的V29、F33）动态结合前体蛋白，维持其延伸构象（图1D）。
- 动态结合机制：前体蛋白在裂隙中快速构象交换（~1.3 ms），通过多弱相互作用实现高亲和力（图6E）。
- 突变致病性：人类TIM8A同源蛋白的Leu81（对应酵母TIM10的+15位点）突变导致耳聋-肌张力障碍综合征，与结合缺陷直接相关（图3E）。
- 底物特异性：α-螺旋载体（如AAC2）主要依赖TIM9•10，而β-桶状蛋白（如Porin）可被TIM8•13部分补偿（图5B）。
结论与意义
科学价值：
1. 首次揭示TIM分子伴侣通过“动态多结合位点”机制模拟共翻译膜蛋白插入过程，解决了核糖体缺失区室（如线粒体IMS）中膜蛋白转运的构象维持难题。
2. 阐明了TIM突变导致线粒体疾病的分子基础（如人类DDD综合征）。
应用价值：为设计靶向TIM系统的线粒体疾病干预策略提供结构依据。
研究亮点
- 方法创新：整合NMR、SAXS和分子动力学模拟，解析高动态复合物的原子级构象。
- 发现新颖性：提出“转移-分子伴侣”（transfer-chaperone）概念，突破传统“静态结合”模型。
- 跨膜普适性：同一TIM系统可同时识别α-螺旋和β-折叠前体，拓展了对分子伴侣功能多样性的认知。
其他价值
研究还揭示了β-发夹构象（β-hairpin）是外膜前体蛋白结合TIM的前提（图2A-D），为理解线粒体与细菌β-桶状蛋白组装机制的差异提供了线索。