本研究由P.X. Petit、N. Glab、D. Marie、H. Kieffer和P. Metezeau等人合作完成，主要作者来自法国国家科学研究中心（CNRS）分子遗传学中心、植物科学研究所细胞计量服务中心以及巴斯德研究所细胞生物化学单位。该研究发表于1996年的《Cytometry》杂志第25卷第28至38页。
该研究属于微生物学与细胞生物学的交叉领域，核心科学问题是酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）的线粒体功能与呼吸代谢状态的单细胞水平检测。在既往研究中，流式细胞术已被用于酵母的生长分析、基因组分析和细胞周期研究，但在区分呼吸功能正常与异常的酵母突变体方面尚缺乏系统性方法。传统微生物学与遗传学筛选方法虽然有效，但通常是群体平均结果，无法反映细胞间的异质性。已有初步研究使用罗丹明123（Rhodamine 123）区分呼吸功能正常与缺陷酵母菌株，但该方法存在局限。为此，本研究旨在建立一种基于DiOC6(3)（一种亲脂性阳离子碳菁染料）的流式细胞术分析体系，并结合共聚焦显微镜与图像细胞术，对酵母呼吸缺陷突变体进行快速、可重复的筛选、鉴定与分选。
研究所用酵母菌株共6株（见表1），包括呼吸功能正常的野生型菌株W303-1B（rho+mit+）和CW04（rho+mit+），以及4株呼吸缺陷突变体：rho0（线粒体基因组完全缺失）、rho-（线粒体基因组部分缺失）、coxI（线粒体基因CoxI点突变，属于rho+mit-类型）和op1（核基因ADP/ATP转运蛋白突变）。这些菌株被培养于YPGA完全发酵培养基至对数期末期，然后转移至YPET完全非发酵培养基中继续培养2小时，以诱导呼吸功能表达。
细胞染色采用了两种荧光探针：DiOC6(3)（3,3‘-二己基氧杂碳菁碘化物）用于检测线粒体膜电位（ΔΨm），染色浓度为0.1 μM，作用30分钟；10-N-壬基吖啶橙（NAO）用于标记线粒体内膜特有的心磷脂，浓度为0.1 μM。解偶联剂mClCCP（羰基氰化物间氯苯腙）以50 μM浓度在染色前加入，用于破坏线粒体膜电位，作为阴性对照。
流式细胞术检测使用EPICS V流式细胞仪，配备氩离子激光器（488 nm激发波长，200 mW功率）。前向角散射光（FALS）与侧向角散射光（RALS）结合用于区分未出芽细胞（map1）和出芽细胞（map2）。DiOC6(3)绿色荧光通过515 nm长通滤光片检测，NAO红色荧光通过610 nm长通滤光片检测。细胞分选基于前向散射对荧光强度的双参数分布进行。细胞活力通过碘化丙啶（PI）排斥试验同步监测。
共聚焦显微镜使用Sarastro 2000系统，对DiOC6(3)或NAO染色的酵母细胞进行0.3 μm步进的连续光学切片。图像细胞术使用交互式激光细胞仪ACAS 570，在488 nm波长和200 mW功率下对荧光定位进行定量分析。
呼吸正常与呼吸缺陷酵母的流式细胞术区分
野生型rho+mit+菌株的光散射分析显示存在两个主要亚群：60-70%的细胞为低FALS和低RALS（map1，代表未出芽细胞），30-40%为高FALS和高RALS（map2，代表出芽细胞）。DiOC6(3)荧光在map1和map2中均呈现双峰分布，map2的平均荧光强度显著高于map1。加入50 μM mClCCP后，两个亚群的荧光均被完全消除，证实该荧光确实反映线粒体膜电位。相反，rho0菌株几乎全部细胞位于map1区域，其DiOC6(3)荧光极低，但仍高于经mClCCP处理的野生型细胞，且mClCCP处理可进一步降低其荧光，表明rho0细胞仍维持一个较低的但可检测的膜电位。
荧光动力学与细胞大小关系
时间进程实验显示，DiOC6(3)染色在15分钟内达到稳态，洗涤后1小时内荧光无明显释放。出芽细胞的荧光强度始终高于未出芽细胞。前向散射与荧光强度的关系曲线呈现两阶段特征：未出芽细胞中，尺寸的小幅增加伴随着荧光的大幅增加；而出芽细胞中，尺寸的大幅增加只伴随荧光的较小幅度增加。
分选细胞的图像细胞术验证
根据FALS将野生型细胞分选至四个门（gate I-IV），图像分析表明：gate I包含97%的未出芽细胞，其中低荧光者为最近分裂后的G0期细胞，高荧光者为即将进入出芽周期的G1期代谢活跃细胞；gate II-IV包含出芽细胞，且随着FALS增加，出芽数目和细胞尺寸均增加。mClCCP处理完全消除了所有门内细胞的荧光，进一步确认了荧光的线粒体膜电位依赖性。
亚细胞定位验证
共聚焦显微镜显示，在低浓度（0.1 μM）条件下，DiOC6(3)荧光严格定位于线粒体结构，出芽区的荧光分布与线粒体网络在细胞分裂中的行为一致。NAO的荧光定位与DiOC6(3)高度相似，但NAO的荧光不受mClCCP影响，证实其结合不依赖膜电位，而是反映心磷脂含量。
混合群体的分析与分选
将rho+mit+与rho0细胞按不同比例混合后进行流式分析，均得到两个分离良好的荧光峰。对50/50%混合群体进行分选后，高荧光门回收的细胞99%为rho+mit+；低荧光门回收的细胞中80%为rho0，20%为rho+mit+。后者可能源于野生型群体中本身存在的低荧光未出芽细胞。
不同呼吸缺陷突变体的系统分析与筛选
对5株呼吸缺陷突变体进行DiOC6(3)与NAO双重染色分析，结果显示：野生型rho+mit+菌株的DiOC6(3)荧光平均通道值为180，rho0为42，rho-为92，op1为160，coxI为113。换算为线性荧光值后，各突变体保留的膜电位相关荧光百分比分别为：rho0为2.8%，rho-为10.2%，op1为58.3%，coxI为17.5%。NAO荧光同样显示出不同程度的下降，且各突变体的NAO荧光分布异质性均高于野生型。图像细胞术分析（每株50-100个细胞）得到的结果与流式细胞术结果趋势一致，rho0保留2.7%荧光，rho-保留39.0%，op1保留86.4%，coxI保留54.0%。
本研究成功建立了基于DiOC6(3)染色的流式细胞术方法，能够快速、可重复地区分酿酒酵母中呼吸功能正常与呼吸缺陷的突变体。在低浓度（≤0.1 μM）条件下，DiOC6(3)特异性标记线粒体而不会染色其他膜结构，且对细胞无明显毒性。该方法的分析速度远快于传统平板筛选，且能够进行活细胞分选，分选后细胞存活率高达98%，可直接用于后续培养与再分析。研究还证明NAO对心磷脂的染色可作为线粒体膜结构完整性的独立指标。ΔΨm的下降通常与心磷脂可染性的下降相关，提示线粒体膜电位的维持对膜结构稳定具有重要作用。在ADP/ATP转运蛋白突变体op1中，ΔΨm仅轻微下降，但NAO荧光显著降低，表明该突变主要影响膜结构而非能量代谢，这为区分不同分子机制导致的呼吸缺陷提供了可能。该方法可进一步扩展至其他细胞功能参数（如pH、钙离子、自由基形成等）的系统筛选，为未知酵母突变体的表型分析与标准化数据库构建提供了技术基础。本研究的创新点在于：首次将DiOC6(3)与NAO双重染色结合流式分选用于酵母呼吸突变体的系统鉴定；通过图像细胞术与流式细胞术的交叉验证确保了方法的可靠性；并展示了该技术在活细胞分选与后续遗传分析中的应用潜力。