本研究由上海交通大学农业与生物学院的陆裕明（Yuming Lu）和南方科技大学医学院的朱健康（Jian-Kang Zhu）共同领导，其他主要作者包括姚启、沈润东、邵阳、田一夫、韩佩瑾和张雪宁。该研究发表于2024年9月2日的《Molecular Plant》期刊（第17卷，第1472-1483页）。

学术背景

本研究属于植物分子生物学与作物育种领域，聚焦于利用基因组编辑技术进行基因表达调控。在植物研究与育种中，上调基因表达至关重要。传统方法主要依赖转基因技术，即引入外源基因过表达盒，但这种方法存在诸多局限，如可能造成非预期的基因组破坏、因插入位点不同导致表达水平不稳定、以及转基因在世代间可能沉默等。CRISPR-Cas系统的发展为基因功能研究带来了革命，最初在基因敲除方面取得成功。近年来，利用失活Cas9（dCas9）招募转录激活因子至特定基因组位点以激活基因表达的技术也得到发展，但这仍然依赖于转基因的整合。

另一种策略是通过原位编辑（in locus editing）改变基因启动子序列来上调基因表达。然而，对启动子进行随机编辑往往需要大量筛选且结果难以预测。随着CRISPR-Cas介导的敲入技术（knockin）在植物中取得进展，特别是在短片段插入方面的突破，使得将特定序列精准插入基因组成为可能。因此，将有效的转录增强子（enhancer）精准插入目标基因的启动子区域，成为一种理论上可编程、稳定且不依赖转基因的原位激活（in locus activation）方法。但这一策略面临两大挑战：一是植物中高效的短片段敲入技术仍有限制；二是缺乏已知的、适用于敲入的、短小且强效的转录增强子。

基于此，本研究旨在开发一种通用的、高效的植物基因上调方法。其核心目标是：1）开发一种大规模挖掘短转录增强子（Short Transcriptional Enhancers, STEs）的方法，以解决增强子资源稀缺的问题；2）利用CRISPR-Cas介导的敲入技术，将这些STEs精准插入水稻基因的启动子区域，实现可编程、可遗传的多重基因激活；3）评估该技术在基础研究和作物育种中的应用潜力。

详细研究流程

本研究包含三个主要环节：1）STE的挖掘与鉴定；2）利用挖掘的STE进行水稻基因的原位激活与功能验证；3）多重基因激活的应用演示。

第一环节：STE的挖掘与鉴定 研究首先致力于解决增强子资源稀缺的问题。团队尝试了两种策略来挖掘有效的STE。 首先，他们从已有的水稻STARR-seq（一种鉴定增强子的高通量方法）数据中选取了5个候选增强子序列（STEos001–STEos005），长度在650-811 bp之间。为了快速评估其活性，研究者构建了一个双荧光素酶报告系统pSTEM01。该系统包含一个作为内参的Nano-luciferase（NLuc）和一个由待测STE驱动的最小启动子（如病毒来源的35S最小启动子或水稻内源基因EUI、RFT1的启动子）控制的Firefly luciferase（FLuc）报告基因。在水稻原生质体中进行瞬时表达实验后发现，这些来自STARR-seq的候选序列增强效果有限。 接着，研究者转向挖掘病毒来源的增强子。他们测试了4个截短的病毒启动子元件（STEvs001–STEvs004），发现来自花椰菜花叶病毒35S启动子的一个254 bp片段（STEvs003）能产生高达2283倍的表达上调。但该片段较长，不利于高效敲入。因此，他们系统性地评估了STEvs003的多个更短衍生物，重点关注核心转录因子结合位点。最终，他们鉴定出一个仅123 bp的片段（STEvs011），其活性与原始的254 bp片段相当，能实现约2000倍的上调，同时一个40 bp的片段（STEvs005）也能实现9.8倍的上调。

为了获得具有不同激活强度且来源内源的STE，研究团队开发了一种名为“STE mining (STEM)”的大规模筛选方法。其核心设计是基于条形码测序的STE文库分析。他们构建了pSTEM02载体，将候选STE序列置于一个报告基因（FLuc）的启动子上游，并在FLuc的N端融合了一个9 bp的条形码序列，该条形码编码一个三肽，用于区分不同STE驱动的转录本。同时，在FLuc中引入了一个内含子，以便在RNA测序（RNA-seq）中明确区分mRNA和DNA序列。 研究者假设水稻中高表达基因（包括看家基因）的启动子区域可能富含高活性STE。通过分析284个水稻RNA-seq数据集，他们从1161个高表达基因的转录起始位点（TSS）上游730 bp区域内，选取了11,610个长度约100 bp的候选STE序列。将这些序列与条形码组合，通过两步法构建到pSTEM02载体中，形成了两个STE文库（分别使用35S最小启动子和水稻EUI基因启动子）。将文库转化水稻原生质体后，提取RNA进行RNA-seq，通过分析条形码的丰度来量化每个STE的增强活性。两个生物学重复显示出高度相关性，证明了该方法的可靠性。通过与阴性对照序列比较，最终鉴定出106个内源STE，其增强活性范围在5.0倍到66.6倍之间。结合之前发现的病毒来源STE，研究获得了一系列具有不同强度转录激活能力的STE资源。

第二环节：STE介导的水稻基因原位激活与功能验证 在获得STE资源后，研究系统评估了STE插入位置对激活效果的影响。利用pSTEM01报告系统，将高活性STE（STEvs011）插入到多个不同启动子（包括35Sminipro、EUIpro、RFT1pro以及另外四个水稻基因HD3A、SLR1、LASPO和QS的启动子）的不同位置。结果表明，STE插入位置对转录增强效果有显著影响，且最强的上调位点普遍位于TSS上游200 bp以内。这一发现为后续原位激活实验的靶点设计提供了重要指导。

随后，研究选取了两个水稻基因EUI（参与赤霉素代谢）和RFT1（控制开花时间）进行STE敲入验证。使用粒子轰击法将STEvs011片段分别敲入到EUI启动子-133 bp和RFT1启动子-66 bp的位置。在获得的再生T0代植株中，分别有9株（EUI）和7株（RFT1）被确认携带了预期方向的STE插入（包括正向和反向）。定量PCR分析显示，编辑植株中EUI和RFT1的转录水平分别实现了最高176倍和869倍的显著上调。表型上，EUI的激活导致了严重的矮化，而RFT1的激活则诱导了在组织培养阶段就出现的极早抽穗。这些结果证明，靶向敲入STE能够有效增强内源基因表达并产生预期表型。值得注意的是，STE无论正向还是反向插入都能产生相似的激活效果，证明了其方向不依赖性。

为了验证原位激活相较于传统转基因的稳定性优势，研究进一步选取了另外两个基因LASPO和QS（两者均为烟酰胺单核苷酸NMN生物合成途径的关键酶）进行多代遗传分析。同样敲入STEvs011后，获得了编辑植株。对T0、T1和T2代纯合植株的分析表明，STE的插入编辑和基因激活效果（LASPO上调最高40.4倍，QS上调最高15.3倍）能够稳定遗传。相应地，编辑植株叶片中的NMN含量也显著提高，从野生型的0.095 mg/100g分别增加到约0.140 mg/100g和0.141 mg/100g，提高了约1.5倍。这证明了STE驱动的上调效应可以稳定遗传并导致相关代谢物水平升高。

第三环节：梯度激活与多重基因激活演示 为了展示对基因表达水平进行精细调控的能力，研究选取了四个具有不同增强强度的STE（病毒来源的STEvs011和STEvs007，以及水稻内源的STEos026和STEos045，它们在原生质体中对35S最小启动子的激活倍数分别为105.1倍、47.2倍、20.1倍和10.2倍）。将这些STE的供体DNA等摩尔混合，通过一次转化实验同时靶向EUI或RFT1基因。结果成功获得了携带不同STE的编辑植株。对于EUI基因，STEvs011、STEvs007和STEos026的敲入分别导致了平均156.0倍、40.0倍和11.2倍的上调，并对应产生了从严重矮化不育到具有农艺价值的半矮秆且可育的梯度表型。对于RFT1基因，STEvs007和STEos026的敲入也分别导致了97.2倍和48.8倍的上调，并诱导了不同程度的极早开花表型。这证明了通过使用不同强度的STE，可以在单次实验中实现对目标基因表达水平的梯度精细调控。

最后，研究展示了多重基因同时激活的可行性。他们瞄准了水稻中NMN从头合成的六酶途径（LASPO, QS, QPRT, NAMNAT, NADS, NADPPase）。通过将针对这六个基因启动子的sgRNA质粒与STEvs011供体DNA混合，一次性转化水稻愈伤组织。通过单次转化，他们鉴定出了多种不同组合的多重敲入突变体，包括10个双敲入、3个三敲入和1个四敲入突变体。对这些突变体的T1-T3代纯合植株进行分析表明，所有靶基因均被同时激活（上调9.9至47.3倍），且激活效果稳定遗传。相应地，这些多重激活株系中的NMN含量也得到显著提升，在四重激活株系中最高达到0.242 mg/100g，是野生型的2.34倍。这证明了该方法能够高效实现多重基因上调，并有效改良代谢通路。

主要研究结果

1. 成功开发了STEM方法并挖掘出系列STE：通过高通量条形码测序技术，从水稻基因组中系统鉴定了106个内源STE，并验证了病毒来源的高效STE（如STEvs011）。这为解决植物基因编辑中增强子资源短缺问题提供了有效工具和资源库。
2. 确立了STE插入的最佳位置：实验证明，STE在启动子区域的位置显著影响其增强效果，最强激活位点通常位于转录起始位点（TSS）上游200 bp以内，且STE的激活作用具有方向不依赖性。这为精准设计原位激活实验提供了关键参数。
3. 实现了高效、可遗传的单基因原位激活：在八个测试的水稻基因中，通过CRISPR-Cas介导的STE敲入，均实现了显著的转录上调（最高达869倍），并产生了强烈的预期表型（如矮化、早花）。多代遗传分析证实，这种基因激活效应和STE插入事件能够稳定遗传，且不同独立株系间的激活水平一致，避免了传统转基因的位置效应和表达变异问题。
4. 实现了对基因表达水平的梯度精细调控：通过使用不同强度的STE，可以在单次实验中实现对同一目标基因不同水平的上调，从而产生从极端表型到温和有益表型的连续变化。例如，使用中等强度的内源STEos026激活EUI基因，成功获得了稳定遗传的半矮秆表型，展示了其在作物性状微调中的应用潜力。
5. 实现了高效的多重基因同时激活：通过单次转化实验，成功实现了对多达四个基因的同时、稳定上调，并显著提升了目标代谢通路（NMN合成）的终产物积累。这证明了该方法在复杂性状（如多基因控制代谢途径）改良中的强大能力。

研究结论与价值

本研究成功开发了一种名为“原位激活”的新型植物基因上调技术。该技术结合了大规模STE挖掘方法（STEM）和CRISPR-Cas介导的精准敲入，能够实现对内源基因的可编程、可遗传、可梯度调控以及多重同时激活。

其科学价值在于：1）提供了一种不依赖转基因、通过原位编辑精确调控基因表达的新范式；2）开发了高通量挖掘植物内源短增强子的方法，丰富了基因调控元件工具库；3）系统揭示了STE插入位置与激活效率的关系，深化了对增强子作用机制的理解；4）证明了通过编辑内源启动子实现稳定、可预测表型变异的可行性。

其应用价值巨大：1）为植物功能基因组学研究提供了强大的基因激活工具，可作为基因敲除的重要补充；2）在作物育种中，该方法能够精确调控农艺性状（如株高、开花时间），实现性状的“微调”，并避免转基因带来的监管和公众接受度问题；3）为多基因协同调控和复杂代谢通路工程提供了高效解决方案。作者预测，随着植物精准敲入技术的不断进步，这种原位激活方法有望在未来几年内像基因敲除一样被广泛应用。

研究亮点

1. 方法创新性：首创了结合高通量STE挖掘（STEM）与精准基因组敲入的“原位激活”技术体系，系统性解决了植物基因编辑中增强子资源稀缺和精准上调困难两大瓶颈。
2. 效果卓越性：实现了高达近900倍的基因转录上调，效果远超多数已报道的启动子编辑或激活因子招募方法，且激活效果稳定、一致、可遗传。
3. 调控精准性：不仅实现了基因的“开”与“关”，更实现了表达水平的“梯度”精细调控，并能同时调控多个基因，展示了极高的可编程性。
4. 资源丰富性：鉴定并验证了超过100个水稻内源STE，为植物合成生物学和基因表达调控研究提供了宝贵的元件资源。
5. 应用前瞻性：成功将技术应用于重要农艺性状（株高、花期）和代谢物（NMN）含量的改良，直接证明了其在作物遗传改良中的巨大潜力。

其他有价值内容

研究还讨论了该技术的局限性与未来优化方向。例如，目前鉴定出的内源STE其激活强度尚未达到病毒来源STEvs011的水平，未来需要进一步优化筛选流程以挖掘更短、更强的内源STE。此外，初步数据显示不同STE可能具有组织特异性激活效应，未来鉴定具有时空特异性的STE对于育种中的定制化表达调控具有重要意义。研究也指出，目前技术在双子叶植物中的应用以及脱靶插入问题仍需进一步解决。随着Prime Editing等更精准编辑技术的发展，DNA片段的敲入将变得更加容易，这将进一步推动原位激活技术的广泛应用。