本研究由复旦大学基础医学院教育部代谢与分子医学重点实验室、附属中山医院内分泌与代谢科的Qian Shuwen、Zhang Chenyang（共同第一作者）以及Zhang Zhao、Tang Qi-Qun（通讯作者）等人完成，发表于 Communications Biology 期刊，2024年7月正式上线。
本文是一项基于小鼠皮下白色脂肪组织的单细胞RNA测序研究，聚焦于出生后早期尤其是断奶前后的脂肪组织重塑过程。白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）不仅负责能量储存与代谢稳态，还在生命早期对环境变化高度敏感。已有的流行病学与实验证据提示，断奶期是脂肪发育和代谢编程的关键窗口。然而，断奶期间WAT中不同细胞类型的组成与功能变化，及其相互作用机制，此前缺乏系统性研究。本研究旨在利用单细胞转录组学结合组织学、分子生物学等手段，构建小鼠腹股沟皮下白色脂肪组织（inguinal white adipose tissue, iWAT）从出生后第7天到第28天的动态细胞图谱，揭示断奶期脂肪组织重塑的细胞基础。
研究的主要工作流程分为多个相互衔接的部分。首先，研究者以组织学方法和分子生物学手段对iWAT进行表型分析。实验对象包括出生后7天（7 d）、14天（14 d）、21天（21 d，断奶点）和28天（28 d）的小鼠。通过H&E染色、UCP1免疫组织化学染色和Western blot，研究者观察到脂肪细胞在21 d时呈现多房脂滴形态，UCP1表达达到峰值，提示断奶期存在“米色化”或产热激活现象。此外，脂肪分解相关酶ATGL和HSL的表达随发育逐渐升高，而脂肪酸合成关键酶ACC在21 d表达最高，表明断奶期脂肪组织代谢活性显著增强。流式细胞术检测了iWAT中免疫细胞的组成，发现21 d时T细胞比例在脂肪组织中较高，而28 d时NKT细胞比例显著升高。Bulk RNA测序进一步显示，从7 d到21 d，能量代谢相关通路（线粒体功能、TCA循环、胰岛素信号、PPAR信号）表达上调，而ECM相关基因表达下调；21 d与28 d相比，部分免疫反应通路活性较低，提示断奶期具有独特的免疫调节状态。
接着，研究者进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。样本来自7 d、14 d、18 d、21 d和28 d的小鼠，每个时间点取两只雄性小鼠的iWAT并混合，经酶消化分离基质血管组分（stromal vascular fraction, SVF）后，利用10x Genomics平台进行单细胞转录组建库和测序。数据分析使用Cell Ranger进行比对，Seurat进行质控、聚类和细胞注释，共获得48,668个细胞，注释为11种主要细胞类型，包括前脂肪细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、NKT细胞、壁细胞、内皮细胞、施万细胞、树突状细胞、肥大细胞和中性粒细胞。结果显示，前脂肪细胞是占比最高的细胞类型之一，且在21 d时比例最高，而巨噬细胞、NKT细胞和树突状细胞的比例在21 d最低，说明断奶期各类细胞发生显著重塑。
在前脂肪细胞的深入分析中，研究者将15,348个前脂肪细胞重聚类为19个亚群（PA0–PA18），并根据既往文献中的标志基因将其划分为DPP4+、ICAM1+和F3+三个亚群。DPP4+前脂肪细胞主要位于结缔组织间隔和脂肪叶边缘，ICAM1+细胞则更多定位于血管结构附近。单细胞数据显示，7 d时ICAM1+前脂肪细胞比例最高，而21 d和28 d时DPP4+群体更为丰富。通过将本研究数据与Merrick等人发表的12 d小鼠前脂肪细胞数据进行整合，研究者构建了覆盖7 d、12 d、14 d、18 d、21 d、28 d和成年期的前脂肪细胞发育轨迹。以7 d细胞为起点，DPP4+和ICAM1+群体均表现为从7 d向21 d发育的趋向，提示断奶期是前脂肪细胞向脂肪细胞谱系定向分化的关键阶段。其中，PA0亚群（DPP4+）在21 d时占全部前脂肪细胞的约40%，高表达Wnt信号和脂肪酸代谢相关基因；PA17亚群（ICAM1+）也在21 d富集，高表达Cebpa、Pparg、Cebpb以及多个脂质合成相关基因，并具有较高的线粒体氧化磷酸化活性，提示其可能分化为具有产热潜能的脂肪细胞。此外，PA6和PA18亚群高表达Mki67和Cdk1等增殖相关基因，其中PA6在21 d显著富集。免疫组织化学和流式细胞术也证实，21 d时iWAT中增殖细胞比例最高，且CIP2A阳性增殖细胞包括DPP4阳性和阴性两种前体，进一步支持断奶期前脂肪细胞经历活跃的增殖和分化转变。
在免疫细胞方面，29,493个免疫细胞被重聚类为29个亚群并注释为7大类。分析显示，B细胞和T细胞均存在断奶期特异性亚群。例如，B细胞i6亚群仅在21 d出现，i8亚群仅在7 d出现；T细胞中i1和i5亚群仅在7 d出现，i3、i13和i19亚群仅在21 d出现。GO分析表明，21 d特异的B细胞和T细胞亚群均高表达ECM相关基因，如多种胶原蛋白和纤连蛋白，提示这些免疫细胞可能通过分泌ECM成分参与前脂肪细胞微环境的调控。而7 d特异的T细胞亚群功能主要富集于T细胞分化、激活和IL-4反应。
为了解析断奶期细胞间的通讯网络，研究者使用CellPhoneDB进行配体-受体互作分析。结果显示，前脂肪细胞与内皮细胞之间的相互作用在所有细胞类型中最为显著。当仅分析TGFβ超家族（包括BMP和TGFβ）的配体-受体对时，前脂肪细胞与内皮细胞的互作在21 d尤为突出，尽管使用全部配体-受体对分析时21 d的总体互作强度相对较低。这一结果提示BMP/TGFβ通路在断奶期脂肪组织重塑中具有特殊重要性。进一步分析发现，DPP4+前脂肪细胞和PA18亚群表达多种TGFβ超家族受体和配体，内皮细胞高表达Bmpr2、Tgfbr2和Tgfb1，壁细胞和施万细胞也表达相应受体，免疫细胞则主要分泌Tgfb1。这些结果为理解断奶期前脂肪细胞的命运调控提供了潜在的分子基础。
本研究的主要结论是，断奶期是iWAT发生显著细胞和分子重塑的关键时期。前脂肪细胞在断奶期发生活跃增殖和谱系定向，部分亚群具有分化为米色或产热脂肪细胞的潜能。同时，断奶期特异的免疫细胞亚群可能通过表达ECM成分影响前脂肪细胞的微环境。此外，前脂肪细胞与内皮细胞之间由TGFβ超家族介导的细胞通讯在断奶期最为密切，提示该信号轴可能在脂肪组织发育重塑中发挥核心调控作用。
该研究的科学价值在于构建了小鼠出生后早期iWAT的单细胞图谱，全面揭示了断奶期脂肪组织重塑中不同细胞类型的动态变化及其潜在互作网络。这为后续研究脂肪组织发育的调控机制、前脂肪细胞异质性以及免疫细胞在脂肪发育中的作用提供了重要资源。从应用角度看，该研究强调断奶期作为代谢编程的关键窗口，可能为早期干预代谢性疾病提供新的思路和时间节点。研究的方法学亮点在于将单细胞RNA测序与组织学、流式细胞术、bulk RNA测序以及公开数据整合分析相结合，并通过CellPhoneDB和Monocle3等工具进行细胞通讯和轨迹推断，系统性强、分辨率高。