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一、研究作者与机构

本研究由Zonglu Wei、Yutong Zhuang、Xinting Liu、Danyang Zou、Kangsen Mai、Zhenzhu Sun和通讯作者Chaoxia Ye*（*华南师范大学生命科学学院现代水产科学与工程学院，广东省健康与安全水产重点实验室，广州市亚热带生物多样性与生物监测重点实验室*）共同完成。研究发表于期刊Aquaculture第564卷（2023年），在线发布于2022年11月15日，文章标题为《Leucine promotes protein synthesis of juvenile white shrimp Litopenaeus vannamei through TOR signaling pathway》。

二、学术背景

科学领域与研究动机

本研究属于水产动物营养学与代谢调控领域，聚焦于必需氨基酸——亮氨酸（Leucine）在甲壳动物（以凡纳滨对虾为模型）中的生理功能。亮氨酸已知在哺乳动物和鱼类中通过TOR（雷帕霉素靶蛋白，Target of Rapamycin）信号通路促进蛋白质合成，并调控葡萄糖代谢，但其在甲壳动物中的作用机制尚不明确。

研究目标

1. 验证亮氨酸是否通过TOR通路调控凡纳滨对虾的蛋白质沉积。
   
2. 探究亮氨酸对肝胰腺结构和葡萄糖代谢的影响。
   
3. 确定凡纳滨对虾饲料中亮氨酸的最适需求量，为优化饲料配方提供理论依据。
   

三、研究方法与流程

1. 实验设计

研究分为体内试验（56天饲喂实验）和体外试验（肝胰腺原代细胞培养）两部分。

2. 体内试验

• 实验对象：540尾初始体重0.67±0.00 g的凡纳滨对虾幼虾，随机分配至18个水族箱（每组3重复，每箱30尾）。
  
• 饲料处理：6组等氮等脂饲料，亮氨酸水平分别为2.10%、2.30%、2.50%、2.70%、2.90%、3.10%（实测值2.10%~2.75%）。
  
• 采样与分析：
  
  • 生长性能：记录增重率（WG）、特定生长率（SGR）。
    
  • 体成分：测定肌肉粗蛋白、粗脂肪及全鱼体成分。
    
  • 血清与肝胰腺葡萄糖：使用自动生化分析仪和商业化试剂盒检测。
    
  • 肝胰腺组织学：HE染色观察纤维细胞数量和面积。
    
  • 基因与蛋白表达：qRT-PCR检测TOR通路关键基因（如AKT、Rheb、S6K等），Western blot分析AKT、p-S6K蛋白水平。
    

3. 体外试验

• 细胞培养：从健康对虾中分离肝胰腺原代细胞，分别在无亮氨酸（对照组）和250 mg/L亮氨酸（处理组）培养基中培养12小时。
  
• 检测指标：
  
  • 细胞活力：CCK-8法测定。
    
  • 基因表达：qRT-PCR分析TOR通路和糖代谢相关基因（如HK、PK、GLUT2）。
    

4. 数据分析

• 使用SPSS 26.0进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较。
  
• 通过二次多项式回归分析确定亮氨酸最适需求量。
  

四、主要研究结果

1. 生长与蛋白质沉积

   • 饲料亮氨酸水平为2.50%时，肌肉粗蛋白含量显著提高（21.93% vs 20.74%，P<0.05），全鱼蛋白沉积达到峰值。
     
   • 回归分析显示，亮氨酸最适需求量为饲料的2.60%~2.67%（占饲料蛋白的6.67%~6.88%）。
     

2. TOR通路激活

   • 2.50%亮氨酸组显著上调TOR、Raptor、AKT、S6K等基因表达（P<0.05），同时抑制负调节因子Sestrin（SESN）和4E-BP。
     
   • Western blot证实AKT蛋白表达量与基因水平一致。
     

3. 葡萄糖代谢调控

   • 2.50%亮氨酸组降低血清和肝胰腺葡萄糖含量（P<0.05），并上调糖酵解基因HK、PK、GLUT2，抑制糖异生基因PC、PEPCK。
     
   • 体外试验中，亮氨酸补充同样激活了肝胰腺细胞的糖酵解通路。
     

4. 肝胰腺结构改善

   • 2.50%亮氨酸组纤维细胞数量和面积显著增加（P<0.05），表明亮氨酸可能通过维持肝胰腺结构完整性促进营养吸收。
     

五、结论与价值

1. 科学意义

   • 首次阐明亮氨酸通过TORC1/TORC2双通路调控甲壳动物蛋白质合成，并揭示其对葡萄糖代谢的协同作用。
     
   • 发现Sestrin可能是甲壳动物中亮氨酸感应TOR通路的关键负调节因子。
     

2. 应用价值

   • 为凡纳滨对虾饲料配方提供了精确的亮氨酸需求参数（2.60%~2.67%），有助于降低饲料成本并提高蛋白质利用率。
     
   • 肝胰腺结构与功能的研究为甲壳动物健康养殖提供了新见解。
     

六、研究亮点

1. 创新方法

   • 结合体内饲喂与体外原代细胞培养，多角度验证亮氨酸的作用机制。
     
   • 首次在甲壳动物中建立肝胰腺原代细胞模型，用于营养代谢研究。
     

2. 重要发现

   • 亮氨酸通过调节Sestrin-TOR轴和糖代谢关键酶，实现蛋白质沉积与能量供应的平衡。
     
   • 确定了亮氨酸对肝胰腺纤维细胞结构的保护作用，拓宽了对甲壳动物营养生理的认知。
     

七、其他有价值内容

• 研究团队通过二次多项式回归精准量化了亮氨酸需求，方法具有可推广性。
  
• 论文引用了大量哺乳动物和鱼类相关研究，为跨物种比较代谢调控机制提供了参考。