Sara Alam、Ying Gu、Polina Reichert、Jürg Bähler 及 Snezhana Oliferenko 等作者在 Current Biology 期刊上发表了这项研究。该研究以两种亲缘关系相近的裂殖酵母——具有呼吸能力的 Schizosaccharomyces pombe 和“专职”发酵的 *Schizosaccharomyces japonicus*——为比较模型，探究在失去呼吸作用后，真核生物如何优化能量生产与中心碳代谢。研究通过稳定同位素示踪代谢组学、质谱同位素异构体分布分析、遗传学和生理学实验，揭示了 S. japonicus 在无氧呼吸条件下维持高效 NADH 氧化、氨基酸合成和 ATP 生成的代谢策略。

该研究的学术背景源于对真核生物中心碳代谢可塑性的关注。大多数真核生物依赖氧气进行呼吸，以高效产生生物量和能量。然而，少数生物丧失了呼吸能力。理解这些生物如何在没有呼吸作用的情况下维持生物量和能量生产，有助于揭示呼吸作用在中心碳代谢中的关键节点，并探索代谢优化的可能路径。糖酵解将葡萄糖分解为丙酮酸，产生少量 ATP 和 NADH。在呼吸作用下，丙酮酸进入三羧酸循环，为氨基酸和核苷酸合成提供前体，并通过电子传递链氧化 NADH 和琥珀酸，驱动大量 ATP 合成。S. pombe 是一种 Crabtree 阳性酵母，在葡萄糖充足时倾向于发酵，但其快速生长仍依赖呼吸作用。S. japonicus 虽然保留了大部分呼吸相关基因，但不产生辅酶 Q，不能利用非发酵碳源，也不消耗氧气。因此，S. japonicus 是研究无呼吸真核生物代谢适应的理想模型。

研究的具体工作流程如下： 第一，研究者首先检测了 S. pombe 和 S. japonicus 野生型及 cox6Δ 突变体（缺失电子传递链复合体 IV 亚基）在富营养培养基中的耗氧率和在基本培养基中的生长速率。结果显示 S. japonicus 几乎不消耗氧气，且 cox6Δ 突变对其生长无显著影响，而在 S. pombe 中 cox6Δ 严重降低耗氧并影响生长。此外，S. japonicus 的 rip1Δ 突变体（缺失复合体 III 亚基）也表现出与野生型相似的生长，说明 S. japonicus 的电子传递链功能丧失并不影响其关键生理状态。 第二，为了探索 S. japonicus 如何在不依赖电子传递链的情况下氧化 NADH，研究者检测了全细胞 NAD⁺/NADH 比值，发现 S. japonicus 的比值与 S. pombe 野生型相似，且高于非呼吸的 S. pombe 突变体。随后，研究者通过稳定同位素示踪实验发现 S. japonicus 将葡萄糖来源的碳掺入甘油-3-磷酸的速度显著高于 *S. pombe*。进一步构建 gpd1Δ 菌株（缺失甘油-3-磷酸脱氢酶）后发现，S. japonicus gpd1Δ 几乎无法生长，而 S. pombe gpd1Δ 的生长不受影响。这表明 S. japonicus 依赖磷酸二羟丙酮还原为甘油-3-磷酸来氧化胞质 NADH。 第三，为了解析三羧酸循环的架构，研究者使用 ¹³C₆-葡萄糖饲喂细胞，并通过气相色谱-质谱联用分析三羧酸循环中间产物的同位素异构体分布。他们重点分析了延胡索酸和琥珀酸的 m+2、m+3 和 m+4 标记比例。结果显示，只有 S. pombe 野生型存在 m+2 延胡索酸，表明其运行循环型三羧酸循环；而 S. japonicus 和非呼吸的 S. pombe cox6Δ 突变体均显示出高比例的 m+3 延胡索酸，提示它们主要运行分叉型三羧酸循环。m+4 延胡索酸在两种酵母中均存在，且可能来自内源性碳酸氢盐的回收和还原分支。 第四，研究者探究了三羧酸循环衍生氨基酸的合成效率。通过标记 α-酮戊二酸和谷氨酸，他们发现 S. pombe 非呼吸突变体的标记水平降低，而 S. japonicus 的标记水平反而高于 S. pombe 野生型。进一步利用 ndi1Δ 突变体（缺失基质侧 NADH 脱氢酶）证明，线粒体 NADH 再氧化对于维持氧化分支的 α-酮戊二酸和谷氨酸合成至关重要。此外，补充精氨酸可以挽救 S. pombe cox6Δ 突变体的生长缺陷。 第五，为了探究 S. japonicus 如何维持高糖酵解活性和高 ATP 水平，研究者检测了 ATP/ADP 比值、葡萄糖摄取速率和糖酵解中间产物丰度。结果显示 S. japonicus 具有比 S. pombe 更高的 ATP/ADP 比值。通过构建 pyk1-A343T 突变体（降低丙酮酸激酶活性）和 pyk1-T343A cox6Δ 突变体（提高丙酮酸激酶活性），研究者发现丙酮酸激酶活性对 ATP/ADP 比值有显著影响，但 S. japonicus 的 ATP/ADP 比值仍高于具有相似丙酮酸激酶活性的非呼吸 S. pombe 突变体。此外，S. japonicus 的葡萄糖摄取速率不受低活性丙酮酸激酶等位基因影响，且其葡萄糖-6-磷酸/果糖-6-磷酸比值低于 *S. pombe*。 第六，研究者通过分析戊糖磷酸途径中间产物和 NADPH 水平，发现 S. japonicus 的葡萄糖-6-磷酸/6-磷酸葡萄糖酸比值远低于 *S. pombe*，且其 NADPH 占总 NADP(H) 的比例显著更高。同时，S. japonicus 中由戊糖磷酸途径非氧化分支合成的苯丙氨酸和酪氨酸的 ¹³C 标记水平也更高。这些结果表明 S. japonicus 可能通过上调戊糖磷酸途径来消耗葡萄糖-6-磷酸，减少对糖酵解上游的反馈抑制，从而维持高糖酵解通量。

研究的主要结论是，S. japonicus 通过三种关键策略优化其无呼吸代谢：第一，依赖磷酸二羟丙酮还原为甘油-3-磷酸来氧化胞质 NADH，同时为脂质合成提供甘油骨架并避免有毒副产物甲基乙二醛的积累；第二，运行完全分叉的三羧酸循环，以氧化还原中性的方式维持草酰乙酸和 α-酮戊二酸的合成，从而支持氨基酸生产；第三，通过高丙酮酸激酶活性和戊糖磷酸途径分流，维持高 ATP/ADP 比值和高糖酵解通量，同时产生 NADPH 和生物量前体。这些发现揭示了真核生物中心碳代谢的可塑性和适应性，并强调了在无氧条件下优化糖酵解而非氧化磷酸化的关键适应。该研究的科学价值在于阐明了呼吸作用在中心碳代谢中的具体贡献，并为理解真核生物代谢进化提供了新视角。其应用价值包括为工业发酵菌株的代谢工程提供理论依据，以及为癌症等依赖糖酵解的疾病研究提供参考。研究亮点在于利用比较生物学方法揭示了无呼吸真核生物的多重代谢优化策略，特别是戊糖磷酸途径作为糖酵解分流的作用。此外，S. japonicus 丢失了 NAD(H) 依赖的异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶，保留 NADP(H) 依赖的对应酶，从而减轻了 NADH 负担，这一发现也值得关注。