南方玉米锈病抗性基因RppK及其效应子AvrRppK的克隆与功能研究

一、研究团队与发表信息
本研究由Gengshen Chen、Bao Zhang、Junqiang Ding等来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的团队主导，合作单位包括河南农业大学、北京市农林科学院等。研究成果于2022年发表在*Nature Communications*（DOI: 10.1038/s41467-022-32026-4）。

二、学术背景
南方玉米锈病（Southern Corn Rust, SCR）由病原真菌*Puccinia polysora*引起，是全球玉米生产的主要威胁之一，可导致50%以上的产量损失。植物免疫系统依赖模式触发免疫（PTI, Pattern-Triggered Immunity）和效应子触发免疫（ETI, Effector-Triggered Immunity），其中NLR（Nucleotide-binding Leucine-rich Repeat）蛋白通过识别病原体效应蛋白（Avr, Avirulence）激活ETI。然而，多数抗性基因因病原体效应子变异而失效，因此克隆广谱抗性基因及其保守效应子对作物育种至关重要。本研究旨在鉴定玉米抗SCR的NLR基因及其对应的*P. polysora*效应子，并评估其育种价值。

三、研究流程与方法
1. 基因定位与克隆
- 材料与群体构建：以抗病自交系K22和感病自交系Dan340为亲本，构建F6:7重组自交系（RIL）群体（192株），通过表型鉴定和QTL分析，将抗性基因*RppK*定位在10号染色体短臂的18.3 kb区间内。
- 精细定位：利用3392个HIF（异质家系）衍生群体筛选402个重组株，将*RppK*缩小至包含3个CC-NLR基因（R1、R2、R3）的候选区域。通过转基因功能验证（转化感病自交系KN5585），确认*R3*基因（重命名为*RppK*）是抗性功能基因。
- BAC文库测序：对K22和Dan340的BAC克隆进行PacBio测序，发现K22中*RppK*区域存在3个串联NLR基因，而Dan340仅含1个同源基因*DR3*。

1. 效应子AvrRppK的鉴定

   • 转录组分析：通过PacBio全长转录组测序，从*P. polysora*中筛选出965个分泌蛋白基因，克隆338个半胱氨酸富集基因。
     
   • 瞬时表达系统：在玉米原生质体和本氏烟中共表达候选效应子与*RppK*，发现*ppg1259*（命名为*AvrRppK*）能特异性触发ETI。
     
   • 蛋白功能验证：纯化AvrRppK蛋白并侵染转基因玉米，证实其直接激活*RppK*介导的免疫反应。

2. 抗性机制与育种应用

   • 保守性分析：对100多个*P. polysora*菌株的*AvrRppK*测序显示其编码区完全保守，且在侵染过程中高表达。
     
   • 免疫抑制功能：过表达*AvrRppK*的玉米植株对PTI（如几丁质诱导的MAPK活性和ROS积累）显著抑制。
     
   • 田间试验：将*RppK*导入杂交种JK968（京724×京92）的亲本，改良品种在SCR流行区增产11.9%-17.1%，且无产量性状损失。

四、主要结果
1. 基因功能验证：
- *RppK*转基因植株对5种*P. polysora*菌株均表现抗性（附图9），而*R2*转基因无效果。
- *AvrRppK*在病原菌侵染早期高表达（图4B），且能抑制PTI信号通路（图4G-H）。

1. 广谱抗性证据：

   • *RppK*与已报道的抗性位点*RppS*（来自SCML205）序列高度相似（仅2 bp差异），表明其为同一基因的不同命名。
     
   • 在500份玉米自交系中，仅17份携带*RppK*，显示其稀有性（附表2）。
     

2. 育种价值：

   • 改良杂交种JK968在SCR压力下产量显著提升（图2F），且农艺性状无变化（附图13）。
     

五、结论与意义
本研究首次克隆了玉米抗SCR的NLR基因*RppK*及其高度保守的效应子*AvrRppK*，揭示了病原菌通过效应子抑制PTI的机制。*RppK*的广谱抗性和育种兼容性为玉米抗病育种提供了新工具，其识别保守效应子的策略可推广至其他作物-病原系统。科学价值在于阐明了NLR-效应子互作的分子基础，应用价值在于直接指导抗病品种设计。

六、研究亮点
1. 方法创新：结合单细胞测序（*P. polysora*基因组）和PacBio全长转录组鉴定效应子。
2. 理论突破：证明核心效应子（core effector）的保守性是可实现广谱抗性的关键。
3. 应用导向：通过分子育种快速改良主栽品种，且无产量代价。

七、其他发现
- *AvrRppK*基因侧翼存在大量重复序列（附图23），可能影响其进化稳定性。
- 本研究为“NLR识别核心效应子”策略的可行性提供了首个直接证据（对比其他病原系统如小麦锈菌）。