本研究由来自河南大学（Henan University）生命科学学院植物逆境生物学重点实验室、棉花生物学国家重点实验室的研究团队完成。主要作者包括吴忠霞（Zhongxia Wu）、何琼婕（Qiongjie He）、曾宝娟（Baojuan Zeng）、周浩丹（Haodan Zhou），通讯作者为周树堂（Shutang Zhou）研究员。该研究于2020年发表在《Development》期刊上（卷147，文章编号dev188813），是一篇开放获取的研究论文。
本研究的核心科学领域是昆虫生理学与分子生物学，具体聚焦于昆虫生殖调控的分子机制。昆虫的繁殖依赖于卵黄原蛋白（Vitellogenin， Vg）在脂肪体中的大量合成，随后Vg被运输并沉积到发育中的卵母细胞内，为胚胎发育提供营养。在包括飞蝗（*Locusta migratoria*）在内的许多昆虫中，幼年激素（Juvenile Hormone， JH）是调控雌性生殖（即促性腺作用）的关键激素，其重要作用之一是诱导脂肪体细胞进行内复制周期（endocycle），形成高度多倍体的细胞，以满足大规模Vg合成的需求。尽管JH通过其受体Methoprene-tolerant （Met）和Taiman （Tai）调控部分内周期相关基因（如MCM4， MCM7， CDC6， CDK6， E2F1）的表达已被报道，但JH诱导脂肪体细胞多倍化的完整信号通路仍有许多未知环节。
研究团队的前期工作发现，JH上调的29个与多倍化相关的基因中，仅有部分受Met调控，提示可能存在其他与JH互作的信号通路参与此过程。胰岛素信号通路与JH通路在昆虫发育和生殖中的交叉对话已被广泛认知。叉头框转录因子O（Forkhead box O transcription factor， FoxO）是胰岛素信号通路的关键下游效应因子，其活性（亚细胞定位和转录活性）受磷酸化/去磷酸化调控。磷酸化的FoxO被滞留在细胞质中失活，而去磷酸化的FoxO则进入细胞核，激活或抑制靶基因的转录。然而，JH是否以及如何通过调控FoxO来影响昆虫生殖，特别是在脂肪体多倍化和卵黄发生中的作用，尚不清楚。
因此，本研究旨在以飞蝗为模型，探究以下科学问题：JH是否调控FoxO的活性（磷酸化状态）？如果调控，其上游信号通路是什么？FoxO的活性变化如何影响下游靶基因，进而调控脂肪体细胞多倍化和卵黄发生？研究的最终目标是揭示JH调控昆虫生殖（特别是多倍化依赖性卵黄发生）的一条新信号通路，填补现有知识的空白。
本研究采用分子生物学、生物化学、细胞生物学和遗传学等多学科方法，进行了系统性的探究。主要流程可分为以下几个部分：
1. JH对FoxO磷酸化状态的动态调控分析 * 研究对象与处理：采集不同发育阶段的成年雌性飞蝗（羽化后0至7天）的脂肪体。同时，设置实验组：对羽化后12小时内的雌蝗使用保幼激素类似物Precocene III进行化学切除咽侧体以消除内源JH，处理10天后，再对其中一部分个体施用JH类似物Methoprene（6-48小时）进行恢复实验。 * 实验方法： * qRT-PCR：检测脂肪体中foxo mRNA在不同发育阶段及上述处理下的表达量变化，以rp49为内参基因。 * 蛋白质印迹（Western Blot）：使用团队自制的高特异性兔源多克隆抗FoxO抗体，以及商品化的抗磷酸化FoxO （p-FoxO）抗体，检测FoxO总蛋白及其磷酸化形式的蛋白水平动态变化。抗体的特异性通过FoxO RNA干扰（RNAi）实验进行了验证（与dsGFP对照组对比）。
2. JH调控FoxO去磷酸化的上游信号通路解析 * 假设验证：基于文献，FoxO可被Akt磷酸化，并被蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2A， PP2A）去磷酸化。PP2A的活性受其催化亚基甲基化（激活）和磷酸化（抑制）的调控，而甲基化由亮氨酸羧基甲基转移酶1（Leucine carboxyl methyltransferase 1， LCMT1）特异性催化。 * 研究对象与处理：同样使用上述发育阶段和JH操纵（Precocene和Methoprene处理）的脂肪体样本。此外，通过RNAi敲低pp2a或lcmt1基因，或使用PP2A特异性抑制剂冈田酸（Okadaic acid， OA）处理脂肪体，来干扰该信号轴。 * 实验方法： * 蛋白质印迹：检测脂肪体中Akt、磷酸化Akt （p-Akt）、磷酸化PP2A （p-PP2A）、甲基化PP2A （m-PP2A， 使用商品化抗体）、LCMT1（使用团队自制抗体）的蛋白水平。LCMT1抗体特异性通过其RNAi实验验证。 * 酶联免疫吸附测定（ELISA）：使用商业化PP2A活性检测试剂盒，定量测量脂肪体提取物中PP2A的磷酸酶活性。 * 表型关联：在敲低pp2a或lcmt1后，检测FoxO/p-FoxO水平、脂肪体细胞倍性（流式细胞术）、Vg表达量（qRT-PCR和Western Blot）以及卵巢发育和卵母细胞成熟状况（形态学测量）。
3. Foxo在脂肪体多倍化与卵黄发生中的功能验证 * 研究对象与处理：对羽化后12小时内的雌蝗注射foxo的双链RNA （dsRNA），并在第5天加强注射一次，于第8天取样分析。dsGFP注射组作为对照。 * 实验方法： * 敲低效率验证：qRT-PCR和Western Blot验证foxo mRNA和蛋白水平的下降。 * 表型分析： * 细胞倍性与形态：通过Hoechst 33342染色观察脂肪体细胞核大小（共聚焦显微镜），并通过碘化丙啶（Propidium Iodide）染色结合流式细胞术定量分析DNA含量，确定细胞倍性分布。 * 卵黄发生相关指标：qRT-PCR和Western Blot检测两种卵黄原蛋白基因vga和vgb的表达水平。 * 生殖表型：解剖并测量卵巢和初级卵母细胞的大小（长×宽指数）。
4. Foxo下游靶基因的筛选与鉴定 * 基因筛选：基于前期发现的23个不受Met调控但受JH上调的基因，通过qRT-PCR检测在foxo敲低后，这些基因的表达变化。发现了cdc2 （细胞分裂周期蛋白2， 也称Cdk1）、orc5 （复制起点识别复合体亚基5）和rfa2的表达显著下降。启动子序列分析显示，cdc2和orc5的上游区域含有保守的FoxO应答元件（FoxO response element， FRE），而rfa2没有，因此后续聚焦于cdc2和orc5。 * 转录调控验证： * 荧光素酶报告基因实验：克隆cdc2和orc5启动子区（含FRE）到pGL4.10载体，与表达蝗虫Flag-FoxO的质粒（或空载体对照）共转染果蝇S2细胞。48小时后检测荧光素酶活性，判断FoxO过表达是否能激活报告基因。 * 电泳迁移率变动分析（EMSA）：合成含FRE的cdc2和orc5启动子序列的生物素标记探针。与转染了Flag-FoxO的S2细胞核提取物共孵育，进行EMSA。通过加入过量未标记竞争探针、突变探针，以及使用抗Flag抗体进行超迁移实验，验证FoxO与靶序列的特异性结合。
5. Cdc2和Orc5在脂肪体多倍化与卵黄发生中的功能验证 * 研究对象与处理：分别对雌蝗进行cdc2或orc5的RNAi，方法与foxo RNAi类似。 * 实验方法：同第三部分，系统评估敲低cdc2或orc5后对脂肪体细胞倍性（流式细胞术）、Vg表达（qRT-PCR和Western Blot）以及卵巢和卵母细胞发育（形态学）的影响。
6. 数据统计与分析 所有qRT-PCR、流式细胞术数据、卵母细胞大小测量数据均以均值±标准误表示。使用SPSS 20.0软件进行统计分析。两组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验。*P < 0.05被认为具有统计学显著性。
1. JH诱导FoxO去磷酸化，且该过程与脂肪体多倍化和卵黄发生期同步。 * foxo的mRNA和总蛋白水平在羽化后0-7天内保持稳定，不受JH剥夺（Precocene处理）或补充（Methoprene处理）的影响。 * 然而，p-FoxO的蛋白水平呈现动态变化：羽化初期（0天）极低，在卵黄发生前期（1-3天）逐渐升高达到峰值，而从卵黄发生期开始（约第4天）显著下降。这与JH滴度在卵黄发生期急剧升高并达到峰值的模式相关联。 * 在JH剥夺的个体中，p-FoxO水平与正常10日龄个体一样维持在较低水平。补充Methoprene后，p-FoxO在6小时短暂升高，但在12-48小时显著降低。这表明长期JH处理促进FoxO去磷酸化。
2. JH通过LCMT1-PP2A信号级联诱导FoxO去磷酸化，而非通过抑制Akt。 * p-Akt和p-PP2A的水平在发育过程中及Methoprene处理后未发生与p-FoxO下降相一致的显著变化，提示Akt或PP2A磷酸化状态可能不是JH诱导FoxO去磷酸化的主要机制。 * m-PP2A（活性形式）的水平和PP2A酶活性在卵黄发生期（第4-7天）显著升高。JH剥夺强烈抑制了PP2A的甲基化和活性，而补充Methoprene可恢复并增强二者。 * 敲低pp2a或使用OA抑制PP2A活性，导致p-FoxO水平升高，但不影响Akt/p-Akt水平，证明PP2A直接介导了FoxO的去磷酸化，且该过程独立于Akt。 * LCMT1的蛋白水平（而非mRNA水平）在发育过程中升高，受JH正调控（JH剥夺降低其水平，JH补充恢复之）。敲低lcmt1显著降低了m-PP2A水平和PP2A活性，并导致p-FoxO积累。 * 表型上，敲低pp2a或lcmt1均导致脂肪体细胞倍性降低、Vg表达锐减、卵母细胞成熟受阻和卵巢发育停滞，且阻断了Methoprene诱导FoxO去磷酸化的能力。 * 结论：JH通过上调LCMT1蛋白表达，促进PP2A催化亚基的甲基化，从而激活PP2A磷酸酶活性，活化的PP2A进而使FoxO去磷酸化。
3. FoxO是脂肪体细胞多倍化、卵黄发生和卵母细胞成熟所必需的。 * 成功敲低foxo后，脂肪体细胞核变小，流式细胞术显示细胞倍性分布从对照组以8C和16C为主，转变为以2C为主，仅存少量8C和16C细胞。 * vga和vgb的mRNA和蛋白表达水平均急剧下降（降至对照的4-6%）。 * 卵巢发育严重受损，初级卵母细胞的长×宽指数显著小于对照组。
4. FoxO直接结合并激活cdc2和orc5的转录。 * 荧光素酶报告基因实验证实，在S2细胞中过表达蝗虫FoxO能显著激活含有cdc2或orc5启动子的报告基因活性。 * EMSA实验证实，FoxO蛋白能特异性结合cdc2和orc5启动子区的FRE序列，该结合可被过量未标记探针竞争掉，被突变探针或抗Flag抗体（导致超迁移）所阻断。
5. Cdc2和Orc5是FoxO下游介导多倍化和卵黄发生的关键效应因子。 * 敲低cdc2或orc5均能重现foxo敲低的核心表型：脂肪体细胞倍性降低（cdc2敲低以2C为主，orc5敲低以4C为主）、Vg表达大幅下降、卵母细胞成熟和卵巢生长严重受阻。其中，cdc2敲低导致的表型缺陷似乎比orc5敲低更为严重。
本研究系统阐明了一条JH调控昆虫脂肪体细胞多倍化和卵黄发生的新信号通路：JH → LCMT1 ↑ → PP2A甲基化/激活 → FoxO去磷酸化 → 入核激活cdc2/orc5转录 → 促进内复制周期与细胞多倍化 → 大规模Vg合成 → 支持多个卵母细胞同步成熟。
科学价值： 1. 揭示了JH信号与细胞周期调控之间的直接分子链接：首次将JH信号通过LCMT1-PP2A-FoxO这一级联反应与内复制周期核心基因（Cdc2和Orc5）的转录激活联系起来，阐明了JH促进多倍化的一个关键机制。 2. 深化了对JH与胰岛素信号通路交叉对话的理解：研究明确了在昆虫生殖特定阶段（卵黄发生期），JH信号可以通过调控PP2A活性来“反向”影响胰岛素通路的关键节点FoxO（使其去磷酸化激活），而不是传统上认为的胰岛素信号通过Akt磷酸化抑制FoxO。这提供了两种重要激素协同调控生殖的新范式。 3. 完善了JH依赖的卵黄发生调控网络：该研究补充了之前发现的JH-Met-Tai调控轴（控制MCMs， CDC6， CDK6， E2F1），表明JH通过两条平行的信号通路（膜信号→LCMT1-PP2A-FoxO 和 核受体→Met-Tai）协同调控一组内周期相关基因，共同驱动脂肪体的多倍化和功能强化，以应对大规模卵黄合成的需求。
应用价值：飞蝗是重要的农业害虫。对其生殖调控核心机制的深入理解，可以为开发以干扰JH信号通路、破坏脂肪体多倍化和卵黄发生的新型靶向性害虫控制策略提供理论依据和潜在的分子靶点（如LCMT1， PP2A， FoxO， Cdc2， Orc5）。
cdc2和orc5来促进多倍化和卵黄发生的具体机制，与其在营养匮乏或滞育条件下的抑制角色形成对比，揭示了FoxO功能的上下文依赖性。研究在讨论部分对比了不同昆虫中FoxO功能的多样性，例如在德国小蠊、赤拟谷盗、埃及伊蚊、大豆食心虫等中FoxO对Vg表达和卵巢发育的调控作用不尽相同，有促进也有抑制，这反映了生殖策略的物种差异以及FoxO整合多种内外信号（营养、JH、保幼激素等）的复杂性。作者指出，未来发现更多调控FoxO功能的因子（如文中提到的Kr-h1）将有助于解释FoxO如何发挥其在靶基因转录中的双重功能。这为后续研究指明了方向。