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作者及机构
本研究的主要作者包括Zi-Kai Wang、Jin-Song Gong、Chang Su、Heng Li、Zhi-Ming Rao、Zhen-Ming Lu、Jin-Shi Shi和Zheng-Hong Xu。他们分别来自江南大学食品生物制造国家工程研究中心、江南大学生命科学与健康工程学院以及江苏省未来食品技术研究所。该研究于2024年9月12日发表在《ACS Synthetic Biology》期刊上，卷号为13，页码为2887-2898。

学术背景
随着绿色制造和生物制造的迫切需求，生物工程领域受到了越来越多的关注。微生物作为基因表达和调控的宿主，在这一领域中扮演着关键角色。传统的质粒表达系统虽然操作方便且产量高，但也存在遗传不稳定性、抗生素污染以及额外的生长负担等问题。因此，将外源基因整合到宿主染色体中进行表达成为了一种更优的选择。本研究旨在构建一种高效、稳定的整合表达系统，以解决质粒表达系统的缺陷，并推动合成生物学和酶工程的应用。

研究流程
本研究分为以下几个主要步骤：
1. 筛选高表达活性整合位点
研究团队首先在E. coli BL21 (DE3)基因组的ori区域筛选了18个整合位点，并利用CRISPR-Cas9技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入这些位点。通过检测GFP的荧光强度，筛选出表达活性最高的整合位点slma。
2. 构建强启动子
研究团队筛选了16个E. coli内源启动子，并将其与T7启动子组合，构建了16个双启动子和10个三重启动子。通过荧光检测，发现plpp-T7双启动子的表达强度比T7启动子高3.3倍。
3. 优化T7 RNA聚合酶表达
为了进一步增强T7表达系统的效率，研究团队在底盘细胞水平上过表达了T7 RNA聚合酶。通过替换T7 RNA聚合酶基因上游的启动子，筛选出能够显著提高GFP表达的启动子alsr。
4. 构建高效整合表达系统
将高表达活性整合位点slma、高表达双启动子plpp-T7以及优化后的T7 RNA聚合酶表达调控结合起来，构建了高效整合表达系统CEIES_Ecoli。
5. 应用验证
研究团队将CEIES_Ecoli系统应用于腈水解酶和透明质酸酶的整合表达，验证了其高效性和稳定性。结果显示，整合表达系统的酶活性与质粒表达系统相当，且无需添加抗生素或诱导剂。

主要结果
1. 高表达活性整合位点的筛选
在18个整合位点中，slma位点的GFP表达强度最高，比最低表达位点melb高2.13倍。
2. 强启动子的构建
plpp-T7双启动子的表达强度比T7启动子高3.3倍，显著提高了整合表达效率。
3. T7 RNA聚合酶表达的优化
通过替换T7 RNA聚合酶基因上游的启动子，筛选出alsr启动子，使GFP表达强度提高了2.72倍。
4. 高效整合表达系统的构建
CEIES_Ecoli系统的GFP表达强度比质粒表达系统高1.98倍，且具有显著的遗传稳定性。
5. 应用验证
腈水解酶和透明质酸酶的整合表达结果显示，CEIES_Ecoli系统的酶活性分别为22.87 U/mL和12,195 U/mL，与质粒表达系统相当。

结论
本研究成功构建了一种高效、稳定的整合表达系统CEIES_Ecoli，该系统无需添加抗生素或诱导剂，能够实现外源基因的高效表达。CEIES_Ecoli系统在合成生物学、酶工程及相关领域具有广泛的应用前景，能够显著降低发酵成本，并避免抗生素残留和滥用问题。

研究亮点
1. 高表达活性整合位点的发现
通过系统筛选，发现了slma位点具有最高的表达活性，为整合表达系统的优化提供了关键位点。
2. 强启动子的设计与验证
通过组合内源启动子与T7启动子，构建了高表达双启动子plpp-T7，显著提高了整合表达效率。
3. 底盘细胞的优化
通过调控T7 RNA聚合酶的表达，进一步增强了整合表达系统的效率，使GFP表达强度达到质粒表达系统的1.98倍。
4. 应用验证的广泛性
通过腈水解酶和透明质酸酶的整合表达，验证了CEIES_Ecoli系统的高效性和稳定性，为其在工业应用中的推广提供了实验依据。

其他有价值的内容
本研究还探讨了整合表达系统在转录水平和翻译水平的优化策略，为未来相关研究提供了新的思路。此外，研究团队还开发了一种基于荧光标记的基因组编辑验证方法，显著简化了整合表达系统的构建流程。