本研究由西南大学园艺园林学院的方珂（Ke Fang）和席万鹏（Wanpeng Xi）等学者完成，发表于 Plant, Cell & Environment 期刊（2026年）。该研究聚焦于桃果实成熟调控的分子机制，特别是MADS-box转录因子在跃变型果实乙烯生物合成中的作用。
一、学术背景
果实成熟是高等植物中最为复杂且具有重要经济价值的发育转变之一。根据呼吸行为和乙烯依赖性，肉质果实可分为跃变型和非跃变型。桃（Prunus persica L. Batsch）是典型的跃变型果实，其成熟过程由一个从自抑制到自催化的乙烯生产转变所触发。在跃变型果实中，基础水平的乙烯（系统I）维持果实处于成熟前状态，随后转变为自催化的大规模乙烯生产阶段（系统II），从而驱动完整的成熟表型。然而，系统II自催化爆发激活的分子机制仍不完全清楚。
MADS-box转录因子家族在植物发育中发挥关键调控作用，尤其在花器官身份决定方面。近年来，MADS-box基因被证实在肉质果实发育和成熟中也具有重要功能。在番茄中，MADS-box基因 RIN 是经典的成熟主调控因子；在香蕉中，MaMADS1 和 MaMADS7 对乙烯生产和成熟至关重要；在苹果中，MdMADS8/9 调控软化和色素积累。然而，桃中调控乙烯生物合成及更广泛成熟网络的关键MADS-box转录因子，特别是它们与乙烯生物合成途径的直接分子关系，仍缺乏系统性的功能表征。
本研究旨在鉴定并功能解析桃成熟过程中关键的MADS-box转录因子，揭示其与乙烯生物合成途径之间的直接调控关系，从而阐明跃变型果实系统II乙烯自催化爆发的分子机制。
二、研究流程与实验设计
本研究采用多层次整合策略，包括基因鉴定、表达分析、瞬时转化、异源表达、激素处理、分子互作及转录调控分析，主要包含以下实验程序：
1. 系统发育与表达模式分析。 研究者从NCBI获取候选桃MADS-box基因的编码序列，与拟南芥、番茄、草莓、香蕉、葡萄、甜橙和苹果中已报道的MADS-box基因进行多序列比对和邻接法系统发育树构建。同时，通过qRT-PCR检测候选基因在叶、茎、花及不同发育阶段果实中的表达水平。所用的植物材料为两个质地对比鲜明的桃品种：溶质型‘晚湖景’（WHJ）和非溶质型‘皮球桃’（PQ），果实采集自重庆北碚桃科技园的树龄和生长势一致的植株。
2. 亚细胞定位与瞬时转化分析。 将 PpMADS2 和 PpMADS4 的全长编码序列克隆到带有GFP标签的植物表达载体pHB-X-GFP中，通过农杆菌介导的瞬时转化在烟草表皮细胞中观察亚细胞定位。随后，在成熟前阶段（花后85天，DAF）的WHJ和PQ桃果实中进行瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默（VIGS）。每个处理至少三个生物学重复。处理后9天收集果实样品，测定乙烯产量、果实硬度、可溶性固形物（TSS）、可滴定酸（TA）、总花青素、总类胡萝卜素及表面色度a*值。
3. 番茄异源过表达验证。 由于桃树童期长、转基因困难，研究者利用模式植物番茄‘Micro-Tom’进行稳定遗传转化。通过农杆菌介导法将 PpMADS2-GFP 和 PpMADS4-GFP 导入番茄子叶外植体，经筛选、分化和生根获得转基因植株。对转基因番茄进行表型观察和生理指标测定，包括株高、叶片形态、开花和果实成熟时间，以及TA、TSS、硬度、a*值和类胡萝卜素含量。
4. 成熟相关基因表达分析。 在瞬时过表达和沉默的桃果实中，通过qRT-PCR分析乙烯生物合成基因（*PpACS1*、*PpACO1*、*PpACS2*、*PpACO2*）、乙烯受体和信号组分基因（*PpETR1*、*PpETR2*、*PpEIN2*、*PpERF095*、*PpERF027*）以及质地、风味和色素相关基因（*PpEXP2*、*PpXTH2*、*PpLOX1*、*PpPSY2*）的表达水平。此外，在自然成熟的桃果实（85、90、115 DAF）中分析这些基因与 PpMADS2/4 表达的相关性。
5. 乙烯与PpMADS2/4调控环路的解析。 对瞬时转化后的桃果实进行外源乙烯利、乙烯受体抑制剂1-MCP和乙烯生物合成抑制剂AVG处理。处理方式为在果实袋内放置商业乙烯利袋（20%有效成分，0.6 g）或1-MCP（0.3 g，1.4 µl/L），或喷施1 mmol/L AVG。处理后9天收集样品，分析 *PpMADS2/4*、PpACS1 和 PpACO1 的表达及生理指标。
6. 酵母单杂交和凝胶迁移实验验证DNA结合。 将 PpACS1 和 PpACO1 启动子约2 kb片段克隆到pAbAi载体，PpMADS2/4 编码序列克隆到pGADT7载体，转化Y1HGold酵母菌株，在含金担子素A的SD/-Leu培养基上评估结合。对启动子中预测的CArG-box基序进行定点突变以验证特异性结合。同时，体外表达并纯化MBP-PpMADS2和His-SUMO-PpMADS4重组蛋白，利用5′生物素标记的含CArG-box寡核苷酸探针进行EMSA实验。SDS-PAGE和免疫印迹使用anti-MBP和anti-GST抗体检测重组蛋白。
7. 酵母双杂交、体外Pull-down和双分子荧光互补验证蛋白互作。 将 PpMADS4 克隆到pGBKT7（BD），PpMADS2 克隆到pGADT7（AD），共转化Y2HGold酵母菌株，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（QDO）培养基上评估互作。同时进行转录自激活分析。体外Pull-down使用MBP-PpMADS2和GST-PpMADS4重组蛋白孵育后通过免疫印迹检测。BiFC实验中，将 PpMADS2 和 PpMADS4 分别克隆到pXY103（nYFP）和pXY104（cYFP）载体，共浸润烟草叶片后48小时用共聚焦显微镜观察YFP荧光。
8. 双荧光素酶报告基因实验。 将 PpACS1 和 PpACO1 启动子克隆到pGreenII 0800-LUC载体作为报告子，PpMADS2/4 编码序列克隆到pGreenII 62-SK作为效应子。以9:1比例混合农杆菌后共浸润烟草叶片，3天后测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性比值。
9. 共过表达与共沉默遗传验证。 在WHJ和PQ成熟前果实中同时进行 PpMADS2 和 PpMADS4 的共过表达和共沉默，分析表型及TSS、TA、乙烯产量、a*值、蔗糖和苹果酸含量，并用HS-SPME-GC-MS测定挥发性芳香化合物，包括γ-癸内酯、顺-3-己烯乙酸酯和己醛。
数据分析采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 10，组间比较使用Student’s t检验或单因素/双因素方差分析及Tukey多重比较检验，P<0.05为显著。
三、主要结果
1. 基因鉴定与表达模式。 系统发育分析显示，Prupe.5G208400 与拟南芥 AtSEP3 和番茄 SlRIN 高度同源，属于SEPALLATA亚家族；Prupe.4G070500 与 CsMADS1 和 SlTAG1 高度同源，属于AGAMOUS亚家族。据此分别命名为 PpMADS2 和 *PpMADS4*。qRT-PCR显示两者在叶和茎中表达极低，仅在花和果实中可检测到。PpMADS2 表达随果实成熟持续增加，PpMADS4 表达先增后略降，在果实转色期（90 DAF）达峰值。这些表达模式与成熟进程正相关，暗示二者参与桃果实成熟调控。
2. 瞬时转化功能验证。 亚细胞定位显示PpMADS2/4均定位于细胞核。在WHJ和PQ果实中过表达 PpMADS2/4 显著促进红色着色，而沉默则抑制颜色转变并保持绿色。过表达显著增加TSS含量和乙烯产量，降低TA含量和果实硬度；沉默则呈现相反趋势。在WHJ中过表达显著增加总花青素和总类胡萝卜素含量，沉默则抑制二者积累；在PQ中花青素变化不显著但类胡萝卜素变化趋势一致。色度计测量显示过表达增加a*值，沉默降低a*值。这些结果表明PpMADS2/4是桃果实成熟的正调控因子。
3. 番茄异源过表达。 转基因番茄株系 PpMADS2-OE 和 PpMADS4-OE 较野生型植株矮、叶宽、主茎短，且更早进入生殖阶段。在移栽后50天，野生型处于盛花期，而转基因株系果实已达早期发育阶段。38 DAF时野生型果实处于膨大期，转基因果实已达橙色期；43 DAF时野生型多为橙色期，转基因果实全部达到红熟期。生理数据显示转基因果实TA含量更低、TSS更高、硬度更低、a*值和类胡萝卜素含量更高，表明PpMADS2/4可加速番茄果实成熟。
4. 成熟相关基因表达变化。 过表达 PpMADS2/4 显著上调乙烯生物合成基因（*PpACS1*、*PpACO1*、*PpACS2*、*PpACO2*）、信号组分基因（*PpETR2*、*PpEIN2*、*PpERF095*、*PpERF027*）及质地、风味和色素相关基因（*PpEXP2*、*PpXTH2*、*PpLOX1*、*PpPSY2*）的表达，沉默则显著下调。其中 PpACS1 和 PpACO1 的变化最显著。在自然成熟过程中，PpACS1 和 PpACO1 的表达模式与 PpMADS2/4 最为相关，提示二者可能是PpMADS2/4的直接靶基因。
5. 乙烯与PpMADS2/4的调控环路。 外源乙烯处理显著诱导 PpMADS2/4 表达。在过表达果实中，乙烯处理促进红变、TSS、乙烯产量、花青素和类胡萝卜素积累，降低TA和硬度；1-MCP处理下过表达果实仍表现出部分成熟表型，表明PpMADS2/4在乙烯信号通路被阻断时仍可促进成熟；AVG处理降低了成熟指标，但过表达果实较对照仍略有增加，说明PpMADS2/4可部分独立于乙烯生物合成驱动成熟。综合表明乙烯通过PpMADS2/4促进成熟，而PpMADS2/4主要影响乙烯合成而非信号转导，二者形成正反馈调控环路。
6. PpMADS2/4直接结合PpACS1和PpACO1启动子。 启动子分析在 PpACS1 和 PpACO1 启动子区域鉴定到PAL型CArG-box顺式元件，而乙烯信号转导基因启动子中未发现。Y1H实验证明PpMADS2/4均可与 PpACS1 和 PpACO1 启动子结合；突变CArG-box后酵母在含金担子素A的培养基上不能生长，表明CArG-box是结合的关键。EMSA进一步验证了PpMADS2/4与 PpACS1 和 PpACO1 启动子中CArG-box的直接结合。
7. PpMADS2与PpMADS4形成功能复合体。 转录自激活分析显示PpMADS2和PpMADS4均无自主转录激活能力。Y2H实验中BD-PpMADS4与AD-PpMADS2共转化后在QDO培养基上生长，表明二者互作。体外Pull-down证实MBP-PpMADS2可拉下GST-PpMADS4。BiFC在烟草细胞核中检测到强YFP荧光。双荧光素酶实验显示PpMADS2/4单独均能激活 PpACS1 和 PpACO1 启动子，共表达时激活活性显著增强，表现为协同效应。
8. 共过表达与共沉默的遗传证据。 在两种桃品种中，共过表达 PpMADS2/4 较单基因过表达产生更明显的红色着色，TSS、乙烯产量、a*值和蔗糖含量更高，TA和苹果酸含量更低；共沉默则产生更强的成熟抑制。γ-癸内酯和顺-3-己烯乙酸酯（桃特征果香挥发物）在共过表达中积累更显著，己醛（绿叶挥发物）降低幅度更大，共沉默呈相反趋势。这些结果为PpMADS2和PpMADS4的体内协同功能提供了直接遗传证据。
四、结论与意义
本研究确立了PpMADS2/4作为桃果实成熟调控网络中的关键转录激活因子。PpMADS2与PpMADS4形成功能复合体，直接结合并激活乙烯生物合成基因 PpACS1 和 PpACO1 的启动子，促进乙烯合成；增强的乙烯合成反过来促进 PpMADS2/4 表达形成正反馈，进一步放大乙烯生产，最终促成系统II自催化爆发并驱动桃果实成熟。
该研究的科学价值在于：（1）揭示了一个新的MADS-box-乙烯调控模块，证明了MADS-box基因即使在缺乏近期全基因组复制的桃中仍保留驱动系统II乙烯合成的能力；（2）发现PpMADS2/4通过形成异源二聚体协同激活靶基因，为MADS-box蛋白的功能多样性提供了新证据；（3）表明MADS介导的成熟控制在跃变型果实中比此前认识的更为广泛，且该调控模块在双子叶植物中功能保守。在应用价值方面，PpMADS2/4可作为调控跃变型果实成熟的通用生物技术靶标，为桃及其他果树的成熟期调控和品质改良提供基因资源。
五、研究亮点