2025年3月10日，一篇题为《拟南芥去甲基化酶REF6与PHYB物理互作促进红光下下胚轴伸长》的研究论文，在《美国国家科学院院刊》（PNAS）第122卷第11期正式发表。该研究由中国科学院遗传与发育生物学研究所的曹晓风研究员和邓娴研究员团队领衔，第一作者为晏艳研究员和朱家平博士，合作者包括中国农业大学的李继刚教授等。这项研究深入揭示了光信号如何通过表观遗传修饰调控植物发育，特别是发现了组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）去甲基化酶REF6在红光介导的光形态建成中的关键作用及其分子机制。
植物光形态建成（photomorphogenesis）是幼苗在光照下从暗形态向光形态转变的关键发育阶段，此过程主要由光受体（如光敏色素）感知光信号并调控下游基因表达来实现。其中，组蛋白修饰作为一种重要的表观遗传调控机制，动态地影响着基因的转录活性，从而影响植物的发育和对环境变化的响应。H3K27me3是一种典型的抑制性组蛋白修饰，主要由多梳抑制复合体2（PRC2）催化形成，并由含有Jumonji C（JMJC）结构域的组蛋白去甲基化酶（如REF6/JMJ12）进行移除。此前研究已知，光敏色素B（phytochrome B, PHYB）作为主要的红光受体，能够与一些表观调控因子（如组蛋白变体H2A.Z沉积复合体SWR1、PRC2组分VIL1）互作，影响染色质状态。然而，光信号如何精确地与H3K27me3的动态修饰相偶联，特别是H3K27me3去甲基化酶如何响应光信号并调控下游生长发育基因，仍是一个 largely obscure 的科学问题。
本研究旨在探究H3K27me3去甲基化酶在光形态建成中的作用，尤其关注REF6。其核心科学问题包括：REF6是否参与光响应？其作用机制是什么？它与主要的光信号传导组分（如PHYB和转录因子PIFs）是否存在协同关系？回答这些问题，将有助于我们理解光受体、表观遗传因子和转录因子三者如何协同工作，从而精细调控植物在变化光环境中的生长。
本研究采用了遗传学、分子生物学、生物化学和基因组学等多学科交叉的研究策略，流程严谨，层层递进。
第一步：遗传学表型筛选与光响应确认 研究首先通过筛选一系列H3K27me3去甲基化酶缺失突变体，观察它们在白光和不同单色光（红光、远红光、蓝光）下的下胚轴伸长表型。实验对象为拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Col-0）及其各种突变体，包括ref6-1、ref6-2、ref6-3、ref6-5、elf6-3、jmj13g、jmj30 jmj32的单突变、双突变及三突变体。每种基因型在每种光照条件下至少有12株幼苗作为生物学重复。结果显示，在红光、远红光和蓝光下，ref6单突变体表现出显著短于野生型的下胚轴，而在黑暗中则无差异。elf6 ref6双突变体和ref6 elf6 jmj13三突变体的下胚轴比ref6单突变体更短，提示ELF6和JMJ13与REF6存在部分功能冗余。这些结果表明，REF6是正向调控光下（尤其是红光下）下胚轴伸长的关键H3K27me3去甲基化酶。
为了确认表型确实由REF6功能缺失导致，研究构建了由REF6自身启动子驱动的REF6pro:REF6-HA互补转基因株系，并将其回补到ref6-1突变体背景中。互补株系成功恢复了突变体的短下胚轴表型。进一步，研究者检测了REF6对光的响应。RT-qPCR分析发现，REF6的转录本水平在不同光质下变化不显著。然而，通过使用特制的REF6抗体进行免疫印迹分析，他们发现REF6蛋白的积累量在光照（特别是红光）下显著高于黑暗条件。此外，通过构建REF6pro:gREF6-GUS报告基因株系并进行组织化学染色，观察到在红光生长的幼苗中，REF6蛋白在茎尖、叶柄、子叶和下胚轴中的积累更强。这些数据共同证明，REF6在蛋白水平上受光诱导积累，这有助于其响应光信号。
第二步：REF6与PHYB的互作鉴定与功能关联分析 为了探索REF6响应光的分子机制，研究者进行了免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）分析，使用组成型表达REF6-YFP融合蛋白的转基因植株。质谱结果提示REF6可能与PHYB等光响应因子存在互作。为了验证这一互作，他们进行了酵母双杂交实验。通过构建PHYB和REF6的不同截短体，发现REF6的第600-900氨基酸区域可以与PHYB的N端结构域（脱辅基蛋白）互作。更为重要的是，利用一个改造的、可在酵母中添加藻蓝胆素（PCB）作为生色团的Gal4酵母双杂交系统，他们能够模拟PHYB的光转换形式。实验表明，REF6更倾向于与PHYB的活性形式（Pfr，吸收远红光）互作，而非非活性形式（Pr，吸收红光）。
随后，体内共免疫沉淀（Co-IP）实验进一步证实了这种光依赖的互作。使用35Spro:PHYB-GFP转基因植株，在暗生长的幼苗经红光或远红光脉冲处理后进行Co-IP。结果发现，红光处理后（促进Pfr形成），与GFP抗体共沉淀的REF6蛋白量远多于远红光处理后，这与酵母实验结果一致。为了探究PHYB是否影响REF6的功能，研究者检测了phyb-9突变体中REF6的水平，发现尽管REF6转录本略有下降，但其蛋白积累在红光下显著减少。这表明PHYB促进了REF6在红光下的积累。
在遗传关系上，研究者构建了ref6-5 phyb-9双突变体。在红光下，双突变体的下胚轴长度介于两个单突变体之间，并与野生型相似。这意味着phyb-9突变体（因PHYB缺失导致下胚轴过度伸长）的表型可以被ref6-5突变所“恢复”到接近野生型水平，表明REF6位于PHYB的下游，并且可能是PHYB促进生长效应的关键介质之一。
第三步：REF6的DNA结合能力与酶活性在其功能中的必要性 REF6蛋白包含N端的JMJC催化结构域和C端的C2H2锌指（C2H2-ZnF）DNA结合结构域。为了探究这两项功能在光响应中的重要性，研究者利用已有的转基因材料，在ref6-1背景中引入了三种不同的回补构建：1）全长REF6pro:REF6-HA；2）酶活性失活突变体REF6pro:REF6H246A-HA；3）缺失锌指结构域的截短体REF6pro:REF6δZnF-HA。表型分析显示，全长REF6能完全回补救突变体的短下胚轴表型；酶活性突变体只能部分回补；而缺失DNA结合结构域的截短体则完全无法回补。这证明，REF6的DNA结合能力和H3K27me3去甲基化酶活性对于其正常的红光响应都是必不可少的，且DNA结合能力可能更为关键。
第四步：基因组学层面解析REF6的功能机制 基于上一步的发现，研究者采用了一系列高通量测序技术，在全基因组范围内描绘REF6的作用图谱。 1. REF6结合靶点鉴定（ChIP-seq）：对红光下生长的Col-0和ref6-5幼苗进行REF6的染色质免疫沉淀测序，在Col-0中鉴定出3735个REF6的结合靶点基因。 2. H3K27me3修饰水平分析（ChIP-seq）：对黑暗和红光下生长的Col-0和ref6-5幼苗进行H3K27me3的ChIP-seq。分析发现，在红光下的ref6-5突变体中，有918个基因的H3K27me3水平显著升高（>2倍）。值得注意的是，其中688个基因同时也是REF6的结合靶点。基因本体（GO）分析显示这些基因富集于细胞生长和形态建成相关过程。 3. 染色质可及性分析（ATAC-seq）：通过测定转座酶可及染色质测序，评估染色质的开放程度。结果显示，在ref6-5突变体中，上述688个重叠基因的转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TES）附近的染色质可及性在红光下显著降低。这表明REF6的缺失导致其靶基因位点染色质变得更加“封闭”。 4. 转录组分析（RNA-seq）：对黑暗和红光下的Col-0和ref6-5幼苗进行RNA测序。发现958个基因在ref6-5突变体红光下的表达量低于野生型（下调≥1.5倍）。其中，171个基因是REF6的结合靶点且H3K27me3水平升高。这个基因集中包含多个已知的生长相关基因，如XTH22（编码细胞壁修饰酶）、DWF4（参与油菜素内酯生物合成）和DUF668（注释为正调控生长因子）。
研究者选取XTH22、DWF4和DUF668作为代表，通过ChIP-qPCR和RT-qPCR验证了上述高通量数据。结果一致显示，在ref6-5突变体中，这些位点的REF6结合、H3K27me3去甲基化水平降低，染色质开放性下降，基因表达诱导受阻。
第五步：PHYB促进REF6与染色质的结合 为了探究PHYB如何影响REF6的功能，研究者对红光下的Col-0、ref6-5和phyb-9幼苗进行了REF6的ChIP-seq比较。分析发现，在phyb-9突变体中，有566个基因位点的REF6结合信号显著减弱。其中包括ROP_GEF2、MYB7和DUF668。通过ChIP-qPCR验证了在phyb-9中这些位点REF6结合的减少。
进一步，通过对Col-0、ref6-5、phyb-9和ref6-5 phyb-9双突变体进行RNA-seq分析，他们鉴定出42个基因，这些基因的表达同时受PHYB正向调控和REF6正向调控（即在phyb-9中下调，在ref6-5中也下调）。这从转录水平证明了PHYB通过促进REF6的结合来协同调控一部分靶基因的表达。
第六步：REF6与PIF4协同调控目标基因 此前研究表明REF6可与转录因子PIF4在高温响应中协同作用。本研究探索了它们在光响应中的关系。遗传学分析显示，ref6-5 pif4-101双突变体在红光下的下胚轴比两个单突变体都更短，表现出加性效应，表明REF6和PIF4在调控红光下胚轴伸长中存在协同作用。其中，DUF668基因的表达在ref6-5、pif4-101以及双突变体中均受到损害，提示REF6与PIF4共同调控该基因的表达，从而介导光响应。
ref6突变体在红光、远红光和蓝光下均表现出下胚轴缩短的表型，且REF6蛋白（而非转录本）在光下积累，尤其在红光下积累显著。XTH22、DWF4、DUF668）上，移除了抑制性的H3K27me3修饰，使得染色质结构更加开放，从而促进这些基因的转录，最终推动下胚轴细胞伸长。phyb-9突变体中，一部分REF6靶基因位点的REF6结合信号减弱，且这些基因的表达也相应下降，证明PHYB不仅稳定REF6蛋白，还增强了其与染色质的结合能力。ref6 pif4双突变体表现出更强的下胚轴抑制表型，且DUF668的表达需要REF6和PIF4共同激活。这表明光信号通路中，光受体（PHYB）、表观遗传修饰因子（REF6）和转录因子（PIF4）形成了一个协同调控网络。这些结果环环相扣：从表型出发，找到关键因子REF6；通过互作筛选找到其上游调控者PHYB；通过功能域分析确认其作用模式；最后通过多维度的基因组学分析，在分子层面完整揭示了“光（PHYB）→ 表观修饰因子（REF6）→ 染色质状态（H3K27me3去除/开放）→ 基因表达（生长相关基因）→ 表型（下胚轴伸长）”的调控链条。
本研究的结论是：在拟南芥中，H3K27me3去甲基化酶REF6是红光介导的下胚轴伸长所必需的。红光激活PHYB，使其转化为Pfr形式。Pfr-PHYB与REF6互作，增强REF6的蛋白稳定性和其在染色质靶位点的结合能力。结合后，REF6通过其C2H2锌指结构域识别特定DNA序列，并利用其JMJC酶活性去除靶基因上的H3K27me3抑制标记，从而开放染色质，促进一系列细胞伸长相关基因（如DUF668）的表达。在此过程中，REF6与转录因子PIF4协同作用，共同精细调控植物的光形态建成。
这项研究的科学价值在于： 1. 建立了光信号与表观遗传修饰的直接分子联系：首次揭示了光受体PHYB如何通过物理互作直接调控一个组蛋白去甲基化酶的活性和靶向性，将光信号快速传递至染色质修饰层面。 2. 阐明了H3K27me3动态修饰在光响应中的具体机制：详细描绘了REF6如何通过序列特异性结合，在光诱导下实现对特定生长基因的H3K27me3去甲基化和转录激活。 3. 提出了光信号传导的协同调控新范式：证明了光形态建成并非由单一线性通路控制，而是涉及光受体（PHYB）、表观遗传因子（REF6）和转录因子（PIF4）三者之间的复杂协作网络。这种协作使植物能够对不同强度、持续时间的光环境做出精细、可调的生长发育决策。 4. 为理解环境信号整合提供了新视角：REF6此前也被报道参与高温响应，并与PIF4、HSFA2协同。本研究揭示了REF6-PIF4模块也参与光响应，提示REF6可能作为一个整合节点，协调多种环境信号（光、温）对共同下游基因的调控。
论文最后也对相关领域进行了展望，提出了未来值得探索的方向：例如，REF6在开放染色质后，是否有特定的染色质重塑因子与其协作？REF6响应不同光质（蓝光、远红光）的机制是否与红光相同？REF6是否与文中提到的、结合 motif 有重叠的MAC3A/MAC3B蛋白协同调控光响应？在自然光波动条件下，这种PHYB-REF6-PIF4模块如何动态运作以优化植物生长？这些思考为后续研究提供了清晰的路线图。
这项由晏艳、朱家平、曹晓风、邓娴等完成的研究，是一项标志性的工作。它成功地将植物光信号传导研究与表观遗传学前沿领域紧密连接，为我们理解植物如何通过整合环境信号与内部遗传-表观遗传程序来调控生长发育，提供了极具价值的见解。