一、 研究团队、发表信息与背景

本研究由来自江南大学的刘延峰教授作为通讯作者领导其团队完成，作者包括齐斌、张佳宁、马文龙、吴耀康、吕雪芹、刘龙、李江华和杜光承。研究成果以题为《Biosensor-Assisted Multitarget Gene Fine-Tuning for N‑Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli with Sole Carbon Source Glucose》的论文形式，发表于*Journal of Agricultural and Food Chemistry*期刊2025年第73卷第9793-9806页。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于微生物代谢工程与合成生物学领域，聚焦于功能性糖N-乙酰神经氨酸的高效生物制造。N-乙酰神经氨酸是一种广泛存在于动物细胞表面的重要唾液酸，在细胞识别、免疫调节、大脑发育等方面具有关键生物学功能，被广泛应用于食品（如婴儿配方奶粉添加剂）和医药行业（如抗病毒药物前体、营养补充剂）。因此，开发高效、低成本的N-乙酰神经氨酸生产技术具有重要应用价值。

传统生产方法如天然提取（从蛋清、燕窝中提取）效率低、成本高昂；化学合成步骤繁琐、污染严重；而酶法和全细胞催化法虽条件温和，但依赖昂贵底物（如N-乙酰葡糖胺、丙酮酸）和辅助因子（如ATP），同样面临高成本挑战。相比之下，以廉价、来源广泛的葡萄糖为唯一碳源的微生物发酵法，具有成本低、环境友好、适合大规模工业生产的显著优势。

尽管已有研究成功在大肠杆菌中构建了N-乙酰神经氨酸合成途径，但现有菌株在使用葡萄糖时普遍面临生产水平低、副产物（尤其是乙酸）积累严重、代谢流分配不均、关键基因表达缺乏精细协调等问题，严重阻碍了其工业化进程。因此，本研究旨在解决这些瓶颈，核心目标是：构建一株能够以葡萄糖为唯一碳源高效合成N-乙酰神经氨酸、且不积累乙酸的大肠杆菌工程菌，并通过建立一套多靶点基因协同精细调控平台，实现关键代谢节点的精确优化，最终获得在工业发酵条件下具有高产量、高生产率的优异菌株。

三、 详细研究流程与方法

本研究工作流程严谨系统，可分为以下四个主要阶段，层层递进：

第一阶段：以葡萄糖为碳源、无乙酸积累的基础底盘菌株构建

• 研究起点：以已发表的、使用甘油时产量可达23.46 g/L的工程菌株NBC45作为出发菌株。但发现该菌株在换用葡萄糖时，N-乙酰神经氨酸产量骤降至1.16 g/L，同时产生高达6.56 g/L的乙酸副产物，严重影响生长和合成效率。
• 研究对象与方法：使用CRISPR/Cpf1系统对NBC45进行一系列基因编辑。
• 详细步骤：
  1. 缓解乙酸积累与优化氧化还原平衡：
     • 问题根源分析：乙酸积累源于快速利用葡萄糖导致的“代谢溢出”。更深层原因是NADH/NAD⁺氧化还原失衡，阻碍了三羧酸循环的正常运行，导致碳流转向乙酸途径。
     • 基因操作：
       • 首先敲除乙酸合成途径基因poxB，但效果不显著，说明需从源头调控。
       • 为解决NADH累积问题，敲除了抑制好氧功能的全局转录调控因子基因arcA和抑制乙醛酸循环的基因ic1R。
       • 在此背景下，引入了来自*Streptococcus mitis*的NADH氧化酶基因nox，该酶可将过量NADH氧化为NAD⁺，恢复胞内氧化还原平衡。
     • 结果验证：此三步组合策略（Δarca, Δiclr, 引入nox）显著减少了乙酸积累，构建的菌株BG02的乙酸产量降至1.95 g/L，N-乙酰神经氨酸产量提升至3.38 g/L。
  2. 改造葡萄糖利用途径，增强前体供应：
     • 问题：大肠杆菌天然通过磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统（PTS）摄取葡萄糖，此过程大量消耗N-乙酰神经氨酸合成的关键前体——磷酸烯醇式丙酮酸。
     • 基因操作：
       • 敲除PTS关键基因ptsG，并引入来自*Zymomonas mobilis*的非PTS依赖型葡萄糖转运蛋白基因glf。此改造避免了PEP消耗，同时提高了葡萄糖摄取和细胞生物量。
       • 敲除糖酵解关键酶基因pfkA，适度减弱糖酵解碳流，将更多碳流向目标产物合成途径。
     • 结果验证：改造后的菌株BG03和BG04显著提升了胞内PEP浓度，彻底消除了乙酸积累，并将N-乙酰神经氨酸产量分别提升至4.28 g/L和5.85 g/L。最终获得的BG04菌株成为性能优良的基础底盘。

第二阶段：关键调控靶点基因的鉴定

• 研究目的：在底盘菌株BG04基础上，系统性地鉴定出对提高N-乙酰神经氨酸产量最为关键的代谢靶点基因。
• 研究对象与方法：针对N-乙酰神经氨酸生物合成途径（UDP-GlcNAc途径）及其辅因子供应模块，共选取了10个候选基因/模块，分别克隆到表达质粒上，在BG04菌株中进行单基因过表达，通过摇瓶发酵48小时，测定产物滴度、副产物积累和细胞生长。
• 详细步骤与关键发现：
  • 筛选结果：
    • 关键正向靶点：过表达来自*Staphylococcus epidermidis*的聚磷酸激酶基因seppk（ATP供应模块）能提高产量，其引入基因组后构建的BG05菌株产量达7.31 g/L。seppk能加速UDP-GlcNAc合成，但同时导致了其前体N-乙酰甘露糖胺的积累。
    • 关键负向/需精细调控靶点：
      • 过表达途径入口酶基因glms（或其抗反馈抑制突变体glmsa*）导致细胞生长严重抑制，产量下降90%，说明该基因表达水平需严格调控。
      • 过表达来自*Streptococcus equi*的双功能酶基因seglmu导致中间产物GlcNAc大量积累（增长2300倍），细胞生长显著促进，但目标产物产量大幅下降。这表明该酶催化的两步反应（GlcN-1-P → GlcNAc-1-P → UDP-GlcNAc）速率严重不匹配，其表达水平需优化以平衡两步反应。
    • 非限速节点：过表达途径中游基因glmm、neuc以及nemneub、谷氨酰胺供应模块（glnA, gdha）、UTP供应模块（pyrH, ndk）对产量无显著提升或产生负面影响。
• 结论：鉴定出glmsa*、glmm和seglmu这三个基因组成的簇是决定代谢流分配和产物合成的协同多靶点关键调控模块。需要通过精细调控这三个基因的表达水平，才能平衡代谢流、避免中间体积累或生长抑制，实现高效合成。

第三阶段：N-乙酰神经氨酸生物传感器的开发与优化

• 研究目的：为后续高通量筛选多基因精细调控文库，需要开发一个能实时、灵敏响应胞内N-乙酰神经氨酸浓度的工具。
• 研究对象与方法：基于来自*Bifidobacterium breve*的转录阻遏蛋白Bbr_NanR构建诱导型生物传感器。当存在N-乙酰神经氨酸时，Bbr_NanR解除阻遏，启动下游报告基因（绿色荧光蛋白，GFP）的表达。
• 详细步骤与创新：
  1. 杂合启动子理性设计：将Bbr_NanR的特异识别序列插入四种不同强度大肠杆菌启动子的上游、中间或下游区域，构建了12个杂合启动子变体。
  2. 响应性能优化：通过测量GFP荧光强度，筛选出基础表达强且能被Bbr_NanR有效阻遏的启动子。进一步，通过更换Bbr_NanR自身的表达启动子为更强的Ptac，并添加RiboJ序列以稳定mRNA，最终获得了高性能生物传感器质粒SNT8。
  3. 性能表征：SNT8对0-20 g/L范围内的胞外N-乙酰神经氨酸表现出良好的线性梯度响应，最大激活倍数（诱导/未诱导荧光强度比）高达10.62倍。将其转入不同产量的菌株中，荧光信号与产物滴度呈正相关，验证了其用于高通量筛选的可靠性。

第四阶段：多靶点基因精细调控文库的构建、筛选与高产菌株发酵验证

• 研究目的：对鉴定出的关键三基因簇（glmsa*-glmm-seglmu）进行协同精细调控，筛选最优表达组合。
• 研究对象与方法：采用一种创新的文库构建策略。将三个基因串联置于Ptac启动子下，但在每个基因的翻译起始区进行随机化设计。
• 详细工作流程：
  1. 文库设计：在每个基因的核糖体结合位点（RBS）与起始密码子之间的间隔区，引入随机化的6个核苷酸序列（NNNNNN），并将起始密码子ATG随机替换为GTG。这两者的组合能精细调控mRNA二级结构和翻译起始效率，从而在单一转录单元内实现三个蛋白表达水平的独立、连续变化。
  2. 高通量筛选：将构建的文库质粒与生物传感器质粒SNT8共转化到底盘菌株BG05中。首先使用流式细胞术分选出荧光强度最高的细胞群体（约占文库的2%）。随后，将分选出的细胞涂布、挑取单克隆至96孔板进行初筛，再选取荧光最高的克隆进行24孔深孔板发酵复筛。
  3. 高产菌株鉴定：通过复筛，成功获得一株高产菌株SA39（后去除传感器质粒后命名为A39）。摇瓶产量达10.12 g/L，比对照提高38.72%。
  4. 序列分析与机制解析：对A39中的文库质粒进行测序，并用RBS计算器预测翻译起始速率。结果显示：
     • glmsa*的翻译速率比原始序列下降68.08%，避免了过表达对生长的抑制。
     • glmm的翻译速率提升69.84%，增强了中间代谢通量。
     • seglmu的翻译速率骤降96.77%（主要因起始密码子变为GTG），有效缓解了其两步反应的失衡。 这精准地实现了“降低入口、增强中游、大幅限制下游”的优化表达模式。
  5. 规模放大验证：将A39菌株在3-L生物反应器中进行补料分批发酵，以葡萄糖为唯一碳源，全程37°C，无需添加昂贵诱导剂IPTG。发酵70小时后，N-乙酰神经氨酸产量达到58.26 g/L，生产率为0.83 g·L⁻¹·h⁻¹，且无乙酸积累。

四、 主要研究结果及其逻辑关联

1. 成功构建无乙酸积累的葡萄糖利用底盘：通过系统性改造（ΔpoxB, Δarca, Δiclr, 引入nox, ΔptsG::glf, ΔpfkA），将菌株从使用葡萄糖时产量仅1.16 g/L且高乙酸积累的状态，改造为产量5.85 g/L且无乙酸积累的底盘菌株BG04。这一结果为后续的途径优化奠定了坚实基础，证明了调控氧化还原平衡和葡萄糖摄取策略的有效性。
2. 精准鉴定出需协同优化的三基因簇：单基因过表达筛选实验不仅证实了seppk的积极作用，更重要的是，揭示了glmsa*和seglmu的过表达会分别导致生长抑制和代谢失衡。这一负向结果至关重要，它明确指出了传统“过表达”策略的局限，并精准定位了glmsa*-glmm-seglmu这一需要精细调控而非简单增强的多基因模块。这一发现直接指导了后续文库构建的目标。
3. 开发出高性能的N-乙酰神经氨酸生物传感器：获得的SNT8传感器具有高灵敏度（10.62倍激活比）和宽线性范围，其荧光信号与菌株产量正相关。这为从海量突变库中快速、高效地筛选出高产菌株提供了强大的工具，是将理性设计与高通量筛选相结合的关键桥梁。
4. 通过协同精细调控获得显著产量提升：基于RBS和起始密码子随机化的文库构建方法，实现了在单一操纵子内对多基因表达的微调。筛选出的A39菌株，其三个关键基因的表达水平被调整至一个前所未有的优化组合，在摇瓶水平即显示出显著优势。这验证了多靶点协同精细调控策略的优越性。
5. 创造了葡萄糖为碳源的最高生产纪录：3-L发酵罐中58.26 g/L的产量和0.83 g·L⁻¹·h⁻¹的生产率，是目前已报道的以葡萄糖为唯一碳源生产N-乙酰神经氨酸的最高水平。这不仅是数字上的突破，其发酵过程（37°C、无需IPTG）更贴近工业化生产的经济性要求，具有巨大的应用潜力。

这些结果环环相扣：底盘构建解决了副产物和基本通量问题；靶点鉴定指明了优化方向；传感器开发提供了筛选工具；文库构建与筛选实现了精确优化；最终规模验证证明了该策略的综合效力。

五、 研究结论与价值

本研究成功开发了一套集代谢途径重构、关键靶点鉴定、生物传感器辅助的高通量筛选、多基因协同精细调控于一体的完整技术体系，并应用于生产N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌细胞工厂构建。

• 科学价值：

  1. 方法论创新：建立了“CRISPR编辑构建底盘 → 模块化过表达鉴定靶点 → 理性设计生物传感器 → RBS/起始密码子文库实现多基因精细调控 → 高通量筛选验证”的代谢工程通用研究范式。
  2. 深入机理认识：阐明了在大肠杆菌中以葡萄糖高产N-乙酰神经氨酸过程中，氧化还原平衡（NADH/NAD⁺）、前体竞争（PEP）、以及关键节点酶（glmsa*, seglmu）表达失衡是主要限制因素，并提出了有效的协同解决方案。
  3. 工具开发：创建了高性能的N-乙酰神经氨酸生物传感器SNT8，为相关研究提供了有力的动态监测和高通量筛选工具。

• 应用价值：

  1. 菌株性能突破：获得的A39工程菌株实现了以廉价葡萄糖为原料、无昂贵诱导剂、高温发酵条件下的高效生产，产量达到国际领先水平，极大地降低了生产成本，为N-乙酰神经氨酸的工业化大规模生产铺平了道路。
  2. 技术可移植性：本研究建立的多靶点基因精细调控策略和传感器辅助筛选平台，可广泛适用于其他微生物代谢工程领域，用于优化复杂的多酶合成途径，具有普遍的借鉴意义。

六、 研究亮点

1. 多靶点协同精细调控：突破了传统代谢工程中单基因过表达或简单组合的局限，通过对一个三基因簇进行翻译水平的协同微调，实现了代谢流的最优分配，这是本研究的核心创新。
2. “设计-构建-测试-学习”闭环的完美实践：从发现glmsa*和seglmu过表达的问题，到设计针对性的调控文库，再到利用传感器进行测试筛选，最终获得最优菌株并解析其机制，完整体现了合成生物学的研究范式。
3. 解决实际工业痛点：研究始终围绕工业化应用需求展开，最终菌株在3-L罐中的发酵条件（37°C、无IPTG、葡萄糖为碳源）具有显著的工业友好性和经济性，验证了其巨大的转化潜力。
4. 创新性的文库构建方法：利用RBS间隔区和起始密码子的随机化来调控同一转录单元内多个基因的表达水平，方法巧妙且高效，为多基因表达调控提供了新思路。
5. 系统性解决问题：研究并非单一技术突破，而是从底盘构建、靶点挖掘、工具开发到最终筛选验证的系统性工程，展现了强大的综合研究能力。

七、 其他有价值内容

本研究还展示了出色的实验严谨性，包括对关键中间代谢物（如PEP）的定量检测、菌株生长和葡萄糖消耗曲线的详细分析、以及工程菌株遗传稳定性的验证（连续传代7天产量稳定）。这些工作为结论的可靠性提供了坚实的数据支撑。此外，研究中使用的CRISPR/Cpf1基因编辑系统、外源基因（如seglmu, seppk）的选择与优化，也体现了团队在分子操作和元件挖掘方面的深厚功底。