本文属于类型a，是一篇单一原创研究论文的学术报告。
研究作者与发表信息
该研究由Rose Syuhada Basri、Raja Noor Zaliha Raja Abd. Rahman、Nor Hafizah Ahmad Kamarudin、Wahhida Latip和Mohd Shukuri Mohamad Ali等人完成，通讯作者为Mohd Shukuri Mohamad Ali。研究团队来自马来西亚博特拉大学（Universiti Putra Malaysia）的生物技术与生物分子科学学院酶与微生物技术研究中心、生物化学系、微生物学系以及农业科学基础研究中心。该论文发表于 Polymers 期刊，文章标题为“Characterization of Carboxylic Acid Reductase from Mycobacterium phlei Immobilized onto Seplite LX120”，于2022年10月17日正式发表，doi为10.3390/polym14204375。
研究背景
该研究属于酶工程与生物催化领域，重点关注羧酸还原酶（carboxylic acid reductase，CAR）的固定化。醛类化合物在精细化学品、制药、香精香料工业中具有广泛应用，而羧酸还原酶能够在辅因子ATP和NADPH存在下，一步催化羧酸还原为醛。然而，游离酶在工业应用中通常面临稳定性不足和成本较高的问题。酶固定化是一种提高酶热稳定性、pH耐受性、储存稳定性和可重复使用性的有效策略。Mycobacterium phlei 来源的羧酸还原酶（mpCAR）是一种中等嗜热酶，此前研究表明其具有较好的热稳定性，但其固定化研究尚属空白。本研究的目的在于首次将mpCAR通过简单吸附法固定化到商业聚合物载体Seplite LX120上，并对固定化酶的性质进行系统表征，以推动其在绿色工业过程中的应用潜力。
研究流程
研究首先制备了纯化的重组mpCAR。研究团队从NCBI数据库获取mpCAR基因序列（WP_003889896.1），并通过密码子优化后在大肠杆菌中表达。同时，为使酶处于活性全息形式，共表达了来源于*Anoxybacillus geothermalis*的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（phosphopantetheine transferase）。细胞在25 °C下经0.75 mM IPTG诱导表达20小时，收集细胞后通过超声破碎和镍亲和层析一步纯化目标蛋白，并用Bradford法测定蛋白浓度。
其次，进行了mpCAR的固定化优化。固定化采用商业阴离子交换树脂Seplite LX120，通过物理吸附实现。优化实验分为两个部分：一是固定化时间的优化，将5 mg蛋白/g载体在25 °C、250 rpm条件下分别搅拌30、60、90、120和150分钟，测定固定化产率和固定化酶活性；二是蛋白负载量的优化，在已确定的最佳时间基础上，测试2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 mg酶/g载体的固定化效果。固定化产率通过初始蛋白含量与未结合蛋白含量的差值计算。实验结果表明，最佳固定化时间为90分钟，最佳蛋白负载量为7.5 mg/g载体，此时固定化产率达到99%，固定化酶活性为184.4 U/g。
随后，研究对固定化mpCAR进行了系统的性质表征。温度影响实验分为酶活性测定和热稳定性测定两部分。酶活性测定在20至80 °C范围内进行，结果显示固定化酶的最适温度为60 °C，而游离酶的最适温度为42 °C。热稳定性实验将固定化酶在10至100 °C预孵育30分钟后于60 °C测定活性，发现其在所有测试温度下均保留60%以上的相对活性。pH影响实验同样包括最适pH和pH稳定性测定。固定化酶的最适pH为9，而游离酶的最适pH为7.5。在pH 4–11范围内预孵育30分钟后，固定化酶仍保留至少50%的活性，且在pH 7时保持100%活性。有机溶剂影响实验考察了25%（v/v）的不同极性和非极性溶剂对游离酶和固定化酶的影响，发现固定化酶在亲水性极性溶剂中保持较高活性，且对疏水性溶剂也具有一定的耐受性。
在形态和结构表征方面，研究使用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）观察空载体和固定化酶的表面形貌，发现酶吸附后载体表面裂缝和空隙被填充，结构更致密连续。BET分析表明，固定化后载体的比表面积从122.3347 m²/g降至108.5485 m²/g，孔径和孔容也有所下降，证明酶成功吸附于载体孔隙中。FTIR光谱分析在1500–1800 cm⁻¹范围内检测到酰胺I和酰胺II特征峰的变化，表明蛋白二级结构在固定化后发生了改变，但酶活性仍得以保持。
储存稳定性和重复使用性研究显示，固定化mpCAR在4 °C下储存8周后保留45.13%的初始活性，在25 °C下保留27.41%；而游离酶在4 °C下4周后仅保留29%，25 °C下4周后仅保留16.33%。重复使用实验中，固定化酶在连续10次催化循环后仍保留59.68%的活性，且反应上清液中未检测到酶泄漏。
最后，研究通过HPLC-UV分析了固定化mpCAR的生物转化能力。以5 mM苯甲酸为底物，分别在20至60 °C孵育1小时，结果显示随温度升高，苯甲醛生成量逐渐增加。在60 °C时苯甲醛浓度约为2.6 mM，生物转化产率为52%，表明固定化酶偏好较高温度进行催化。
主要研究结果
固定化优化实验确定了最佳吸附条件，即每克Seplite LX120负载7.5 mg mpCAR，在25 °C、250 rpm下搅拌90分钟。温度实验表明固定化显著提高了酶的热稳定性，最适温度从42 °C提高到60 °C，且在10–100 °C范围内保持良好活性。pH实验显示固定化酶的最适pH从7.5偏移至9，并在pH 4–11范围内保持稳定。有机溶剂实验证明固定化酶在亲水性溶剂中活性较高，对疏水性溶剂也有一定保护作用。SEM、BET和FTIR分析均证实了酶成功吸附且结构变化未导致活性丧失。储存和重复使用实验显示固定化酶具有比游离酶更好的长期稳定性和重复使用能力。生物转化实验则直接证明了固定化mpCAR能够在60 °C下将苯甲酸转化为苯甲醛。
结论与研究意义
本研究首次成功将*Mycobacterium phlei*来源的羧酸还原酶固定化到聚合物载体Seplite LX120上，并通过吸附法实现了高效固定化。固定化后的mpCAR在温度、pH、有机溶剂耐受性、储存稳定性和重复使用性方面均表现出显著改善。该研究为羧酸还原酶的固定化提供了新方法，拓展了其在生物催化和绿色化学领域的应用潜力，尤其在香精香料工业中生产醛类化合物方面具有重要的应用价值。
研究亮点
本研究的亮点在于首次报道了细菌来源的羧酸还原酶固定化到聚合物载体上的工作。此外，固定化过程简单、无需化学修饰，且酶活性保持良好。固定化酶在最适温度、pH稳定性、有机溶剂耐受性和可重复使用性方面均优于游离酶，展现出优异的工业应用特性。尤其是固定化mpCAR能够在60 °C下有效催化苯甲酸转化为苯甲醛，这一温度远高于此前报道的其他羧酸还原酶固定化体系，显示了其独特的热稳定性优势。