本研究由Yujing Hu、Jiayi Ji、Hao Cheng、Rongli Luo等人共同完成，其中Yujing Hu、Jiayi Ji、Hao Cheng和Rongli Luo为共同第一作者。通讯作者为Jie Zhang和Yuncong Yao，均来自北京农学院（Beijing University of Agriculture）的北京林木分子设计育种高精尖创新中心（Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design）及植物科学技术学院。该研究成果于2022年11月10日在线发表于*Journal of Advanced Research*第51卷（2023年），页码27至44，论文DOI为10.1016/j.jare.2022.11.005。
花青素（anthocyanin）是植物中重要的类黄酮色素，不仅赋予植物丰富的色彩，还作为抗氧化剂参与植物对多种生物和非生物胁迫的防御。已有研究表明，microRNA408（miR408）在拟南芥（Arabidopsis）中受铜（copper, Cu）条件影响，并正向调控花青素生物合成。然而，在苹果属（Malus）植物中，miR408如何通过铜稳态（copper homeostasis）和活性氧稳态（reactive oxygen species, ROS homeostasis）介导花青素生物合成的机制尚不明确。
铜是植物生长必需的七种微量元素之一，是多种含铜酶和蛋白的重要辅因子。铜缺乏会严重威胁作物产量和品质，而铜过量则对植物产生毒性。因此，维持铜稳态对植物生长发育和适应外界铜含量波动至关重要。miR408是植物中最保守的miRNA家族之一，其靶基因编码属于植物蓝铜蛋白（phytocyanin）家族的铜结合蛋白。在拟南芥中，miR408被证明在HY5-SPL7模块中协调光和铜的响应，过表达miR408可增加花青素积累。然而，miR408如何桥接光信号与细胞内铜稳态，进而调控花青素生物合成的调控通路仍需阐明。与此同时，ROS作为重要的信号分子参与多种生物学过程，铜胁迫下植物会积累大量ROS，但铜稳态与ROS稳态之间的关系尚不清楚。
基于上述背景，本研究旨在阐明miR408a及其靶基因碱性蓝蛋白（basic blue protein, BBP）如何通过调控铜稳态和ROS稳态来影响苹果属植物的花青素生物合成，特别是在光诱导和铜胁迫条件下的分子机制。
本研究采用了多种分子生物学、遗传学和生化技术手段，主要包括以下几个实验环节：
1. 植物材料与处理条件。 研究使用了苹果属海棠品种‘Royalty’和苹果‘Golden Delicious’组培苗，以及烟草（Nicotiana benthamiana）和‘Stolav’苹果果实。组培苗在含不同浓度CuSO₄的MS培养基上培养（无铜、正常铜0.1 μM、1 μM、10 μM和100 μM铜），分别在处理1、3、5和10天后采集叶片和茎段。苹果果实在套袋160天后进行光照处理（12000 lx，16小时光照/8小时黑暗），在光照处理后0、3、5、8和12天取样。
2. RNA提取与实时定量PCR分析。 采用RNA提取试剂盒从叶片和茎中提取总RNA，利用逆转录酶合成cDNA。通过qRT-PCR检测miR408a及花青素合成相关基因（CHS、ANS、DFR、UFGT、GST）、铜结合蛋白基因（BBP、LAC3、CSD1）、铜转运基因（ATX1、COPT6、CCO2）以及木质素合成途径基因的表达水平。miRNA使用特异性引物和通用引物进行逆转录和检测，以U6和18S rRNA作为内参。
3. 载体构建与农杆菌介导的瞬时转化。 从‘Royalty’叶片中克隆了miR408a前体序列（123 bp）和MdBBP编码序列（372 bp），分别构建过表达载体（pCAMBIA1300骨架）和病毒诱导的基因沉默载体（pTRV2骨架）。将构建好的载体转入农杆菌GV3101，通过真空渗透法瞬时转化苹果组培苗或注射苹果果实，观察表型并进行后续分析。
4. RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（RLM-RACE）。 利用RLM-RACE技术验证miR408a对BBP转录本的切割位点，确认二者的靶向关系。结果显示切割位点位于互补序列第十和第十一个碱基之间。
5. 生化指标测定。 采用高效液相色谱（HPLC）在520 nm波长下检测花青素含量；采用电感耦合等离子体光谱法（ICP）测定植物组织中的铜含量；木质素含量采用Bruce & West方法进行定量。
6. 蛋白互作分析。 利用酵母双杂交（Y2H）系统验证BBP与LAC3及CSD1的互作关系。将MdBBP克隆入pBT3-SUC和pBT3-STE载体，将MdCSD1和MdLAC3克隆入pPR3-N载体，共转化酵母AH109菌株，在选择性培养基上检测蛋白互作。进一步采用双分子荧光互补（BiFC）实验在烟草叶片中验证BBP与LAC3、CSD1的体内互作，通过激光共聚焦显微镜观察YFP荧光。
7. 亚细胞定位分析。 将MdBBP和MdCSD1的编码序列（不含终止密码子）克隆入pHBT-EGFP-NOS载体，通过基因枪法导入拟南芥原生质体和洋葱表皮细胞，观察EGFP荧光定位。结果显示BBP定位于细胞膜和液泡膜（tonoplast），CSD1定位于叶绿体。
8. 生物信息学分析。 利用Swiss Model进行三维结构预测，使用MEGA 6.0构建系统发育树，利用Plant-mPLoc、CELLO和Wolf PSORT等在线工具进行亚细胞定位预测。此外，通过生物膜干涉技术（Biolayer Interferometry, BLI）分析了MdMYB16蛋白与miR408a启动子元件的结合亲和力。
1. miR408a靶向碱性蓝蛋白MdBBP。 通过miRNA测序发现，红色叶‘Royalty’中miR408a的表达量比绿色叶‘Flame’显著上调3.6倍。靶基因预测和RLM-RACE实验确认MdBBP是miR408a的剪切靶标。生物信息学分析显示MdBBP含有一个跨膜螺旋和植物蓝铜蛋白（plantacyanin）保守结构域，其I型铜结合位点为H(67)-C(107)-H(112)-M(117)。亚细胞定位实验证实BBP定位于细胞膜和液泡膜，提示其可能作为营养铜传感器参与铜稳态调控。
2. MdBBP与MdLAC3和MdCSD1互作。 酵母双杂交实验表明BBP与漆酶3（laccase 3, LAC3）和铜锌超氧化物歧化酶1（Cu/Zn SOD, CSD1）均能互作，在含有X-α-gal的选择性培养基上酵母菌落变蓝。BiFC实验进一步在烟草叶片中证实了BBP与LAC3及CSD1的体内互作。CSD1定位于叶绿体，LAC3预测定位于细胞膜和胞外。这些互作暗示铜稳态与ROS稳态之间可能存在由miR408介导的交互调控。
3. miR408a正向调控苹果属植物的花青素生物合成。 瞬时过表达miR408a（OE-miR408a）显著提高了成熟miR408a水平，同时降低了BBP转录水平，叶片呈现红色且花青素含量显著增加，CHS、ANS、DFR和UFGT基因表达显著上调。相反，沉默miR408a（TRV-miR408a）导致叶片着色减少、花青素含量降低，上述基因表达下调。在苹果果实中，过表达miR408a同样促进着红色并增加铜含量和花青素含量，而沉默miR408a则降低着色和铜含量。此外，miR408a过表达果实中BBP、LAC3、CSD1和铜转运基因ATX1、COPT6表达下降，而木质素途径基因C4H、4CL、CCOA-OMT、COMT和CAD表达上调。
4. 光诱导下miR408a-BBP模块调控铜稳态和花青素生物合成。 随着光照天数增加，苹果着色显著加深，花青素含量逐渐上升。DFR、ANS、UFGT和GST表达显著升高。miR408a丰度和铜含量在光诱导下均显著上调，而BBP、LAC3和CSD1的表达显著下降。铜转运基因ATX1、COPT6和CCO2在光照处理5天后显著上调。这些结果表明光信号通过上调miR408a、抑制BBP，进而促进铜积累和花青素合成。
5. BBP负向调控铜稳态和花青素生物合成。 过表达BBP（BBP-OE）的苹果果实花青素积累减少，铜含量显著降低，CHS、DFR、UFGT和GST表达下降。同时，LAC3、CSD1和铜转运基因ATX1、COPT6、CCO2表达均下调，木质素途径基因表达也下降。沉默BBP（BBP-TRV）则呈现相反趋势。这些结果表明BBP通过负调控铜稳态来抑制花青素生物合成。
6. miR408a-BBP-LAC3/CSD1模块参与叶片颜色转变。 在‘Royalty’叶片五个发育阶段（S1至S5）中，随着叶片生长红色逐渐变浅，花青素含量从S3期急剧下降，而木质素含量显著增加。miR408a表达自S2期显著上调，BBP、LAC3和CSD1表达则同步下调，与花青素含量变化趋势相反。
7. 铜胁迫下miR408a和BBP的表达受到调节。 在100 μM铜处理下，‘Royalty’和‘Golden Delicious’组培苗叶片呈现红色加深，花青素含量显著增加。miR408a表达显著下降，而BBP、LAC3、CSD1表达显著上升；铜转运基因ATX1、COPT6和CCO2表达显著下降。在铜缺乏条件下，叶片呈绿色，花青素含量降低，miR408a表达显著上调，BBP、LAC3、CSD1表达下降，COPT6表达显著上调。两种铜极端条件下植株均表现矮化，表明铜稳态失衡影响营养生长。
本研究首次揭示了苹果属植物中miR408a-BBP-LAC3/CSD1模块通过铜稳态与ROS稳态的交互作用调控花青素生物合成的分子机制。BBP作为miR408a的直接靶标，通过与LAC3和CSD1互作，协调铜离子结合和ROS清除，从而整合光信号和铜信号调控花青素积累。在过量铜条件下，miR408a下调导致BBP上调，促进铜离子结合和向液泡转运以维持铜稳态，同时CSD1上调清除过量铜诱导的ROS，促进花青素抗氧化积累。在铜缺乏条件下，miR408a上调抑制BBP，减少铜结合蛋白表达，同时上调铜转运基因COPT6以维持细胞内铜水平。
该研究不仅阐明了microRNA在铜稳态调控中的核心作用，还首次建立了铜稳态与ROS稳态之间的分子连接，为理解植物如何感知和响应铜营养信号以及光信号提供了新视角。在应用层面，该研究为通过调控miR408a-BBP模块改良苹果果实着色、提高植物铜胁迫耐受性以及优化铜营养管理提供了潜在的分子靶点和理论依据。
本研究的亮点主要体现在：第一，首次在苹果属植物中鉴定了miR408a靶向BBP并调控花青素生物合成的完整通路；第二，首次证明了BBP蛋白同时与LAC3和CSD1互作，将铜稳态与ROS稳态联系起来；第三，提出了在铜过量与铜缺乏以及光诱导条件下miR408a-BBP-LAC3/CSD1模块的动态调控模型；第四，该研究将microRNA调控、铜营养信号、ROS信号和次生代谢（花青素与木质素）整合在一个统一的调控框架中，具有重要的理论创新性。