作者Zhang Xiao-Ran、He Jia-Bei、Wang Yi-Zheng和Du Li-Lin（通讯作者）在《G3: Genes|Genomes|Genetics》期刊上于2018年6月发表了一项关于在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中建立一种无需克隆步骤的CRISPR/Cas9基因组编辑方法的研究。该研究的主要完成单位包括北京生命科学研究所、中国农业大学生物学院和清华大学PTN研究生项目。
一、研究背景与目的
CRISPR/Cas9系统作为一种强大的基因组编辑工具，依赖于RNA引导的DNA切割来诱导位点特异性的DNA双链断裂（double-strand break, DSB）。该系统已成功应用于粟酒裂殖酵母，通过从质粒表达Cas9蛋白和单链引导RNA（single-guide RNA, sgRNA）来实现基因组编辑。然而，在已发表的方法中，将特定的sgRNA靶序列克隆到质粒中的步骤最为繁琐和耗时。该步骤通常需要数天时间，涉及DNA操作、转化大肠杆菌（Escherichia coli）细胞、质粒制备以及测序验证等。
为了克服这一瓶颈，本研究的作者设想通过粟酒裂殖酵母细胞内高效的同源重组介导的缺口修复（gap repair）过程来组装Cas9-sgRNA质粒，从而省略克隆步骤。因此，本研究的核心目标是开发一种基于缺口修复的、无需克隆的CRISPR/Cas9基因组编辑方法，并验证其在点突变敲入（point mutation knock-in）、内源性N端标记（endogenous N-terminal tagging）和基因组序列删除（genomic sequence deletion）中的应用效果。
二、研究方法的详细流程
本研究的方法核心是利用粟酒裂殖酵母细胞内的缺口修复机制，将两个线性DNA片段——一个带有缺口的Cas9编码质粒和一个通过PCR扩增的sgRNA插入片段——组装成一个环状质粒。这两个片段分别只包含选择标记（selectable marker）的一部分序列：缺口质粒含有选择标记的5’端部分，而sgRNA插入片段含有选择标记的3’端部分。因此，只有正确组装后的环状质粒才能形成完整的选择标记基因，从而使宿主细胞获得相应的营养缺陷型恢复或抗生素抗性。
1. 质粒的构建与线性化
研究团队构建了两套系统：split-ura4系统和split-bsdmx系统。在split-ura4系统中，他们从质粒pMZ374出发，构建了pDB4280和pDB4282两个质粒。pDB4280含有Cas9编码序列和ura4标记的5’端部分，经NotI酶切后产生10,201 bp的缺口质粒；pDB4282含有ura4标记的3’端部分、锤头状核酶（hammerhead ribozyme）编码序列和sgRNA支架（sgRNA scaffold）序列，经NotI酶切后产生1,354 bp的PCR模板。在split-bsdmx系统中，首先通过缺口修复将pMZ374中的ura4标记替换为赋予灭瘟素S（blasticidin S）抗性的bsdmx标记，得到pDB4279。然后类似地构建了pDB4281（9,800 bp缺口质粒）和pDB4283（931 bp PCR模板）。
2. sgRNA插入片段的扩增
sgRNA靶序列（20个核苷酸）位于前间隔序列邻近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）序列（NGG）的上游。设计一个83 nt的sgRNA引物，其中包含40 nt的rrk1前导序列（leader sequence）、20 nt的sgRNA靶序列和23 nt的sgRNA支架序列。使用高保真DNA聚合酶，将该sgRNA引物与一个通用引物配对，从相应的PCR模板扩增出sgRNA插入片段。在split-ura4系统中，PCR产物为1,375 bp，两端分别含有158 bp和40 bp的与缺口质粒重叠的序列；在split-bsdmx系统中，PCR产物为952 bp，两端分别含有156 bp和40 bp的重叠序列。
3. 供体DNA（donor DNA）的设计
为了实现精确的基因组编辑结果，供体DNA携带预期突变。如果该突变不会消除Cas9的切割，则在sgRNA靶序列的最后10个核苷酸或PAM序列中引入至少一个额外的同义切割阻断突变（synonymous cleavage-blocking mutation）。对于敲入或敲除，供体DNA以一对90 nt的反向互补合成寡核苷酸形式提供。对于N端标记，供体DNA以PCR产物形式提供，包含标记序列及其两侧的同源臂序列。
4. 转化与筛选
将缺口质粒（30 ng）、sgRNA插入片段PCR产物（200 ng）和供体DNA共转化到适当的粟酒裂殖酵母菌株中，使用醋酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇方法。split-ura4系统要求宿主菌株携带ura4-D18等位基因，该等位基因是ura4标记的完全缺失。转化后在缺乏尿嘧啶的PMG培养基上筛选尿嘧啶原养型（uracil prototrophic）转化子，菌落形成通常需要6-8天。split-bsdmx系统要求宿主菌株不具有灭瘟素S抗性标记，转化后在含有30 μg/ml灭瘟素S的YES培养基上筛选抗性转化子，菌落形成通常需要4-6天。
正确的基因组编辑结果通过评估预期突变的表型来判定。例如，rpl42-P56Q突变赋予放线菌酮（cycloheximide）抗性；tor2-L2048S和cdc25-C532Y突变赋予温度敏感表型；ypt7的N端mecitrine标记通过荧光显微镜观察空泡膜定位；mat1-Δ17缺失通过碘蒸气染色判断接合型转换能力的丧失。
值得注意的是，Cas9对粟酒裂殖酵母细胞具有不依赖于sgRNA的生长抑制效应（growth inhibitory effect），因此稀有的快速生长转化子菌落通常不含预期的基因组编辑结果，这些菌落在计算转化效率和编辑效率时被排除。
三、研究的主要结果
1. 点突变敲入效率
使用split-ura4系统敲入rpl42-P56Q突变（该突变赋予放线菌酮抗性），编辑效率达到84%，与使用克隆质粒的方法相当。然而，缺口修复方法的转化效率比使用环状质粒的方法高出10倍以上。使用split-bsdmx系统敲入rpl42-P56Q突变同样获得了相当的编辑效率，但转化效率较低。
通过优化实验参数，确定了30 ng缺口质粒和200 ng sgRNA插入片段为最佳用量，约对应1:50的摩尔比。在供体DNA形式方面，发现单链90 nt供体寡核苷酸（无论是正义链还是反义链）都能作为供体，但敲入效率明显低于同时提供两条寡核苷酸的情况。
2. 温度敏感突变敲入
使用split-ura4系统敲入两个温度敏感突变：tor2-L2048S和cdc25-C532Y。tor2-L2048S突变的敲入效率为34%和27%（分别使用两个不同的sgRNA），而cdc25-C532Y突变的敲入效率为16%和2%。对于效率较低的情况，研究者通过PCR和Sanger测序分析发现，在tor2-L2048S突变中，绝大多数无温度敏感表型的转化子含有PAM破坏性沉默突变，表明Cas9切割和供体重组效率很高，但远端突变的整合仅发生在部分重组产物中。这些实验证明了该方法对点突变敲入的普遍适用性，也提示sgRNA切割效率存在变异性。
3. N端标记
使用split-ura4系统对ypt7基因进行N端mecitrine荧光蛋白标记。使用sgRNA1时，标记效率约为60%，且同源臂长度从50 bp到200 bp均有效；而使用sgRNA2则完全未能获得正确标记的克隆，进一步证实了不同sgRNA在靶向效率上的差异性。
4. 基因组序列删除
使用split-bsdmx系统在自然分离株JB938中生成mat1-Δ17缺失（删除140 bp序列），转化效率超过90%。这一结果表明split-bsdmx系统可有效用于编辑非实验室粟酒裂殖酵母菌株的基因组。
四、结论与意义
本研究成功开发了一种基于缺口修复的、无需克隆的CRISPR/Cas9基因组编辑方法，适用于粟酒裂殖酵母。该方法的核心创新在于分裂标记（split-marker）设计：缺口质粒和sgRNA插入片段各自只含选择标记的一部分，只有通过正确的缺口修复组装才能形成完整的选择标记，从而有效避免了背景转化问题。该方法可快速高效地实现点突变敲入、内源性N端标记和基因组序列删除。
该研究的科学价值在于：首先，它显著缩短了在粟酒裂殖酵母中应用CRISPR/Cas9技术的时间，将原本需要数天的克隆步骤简化为一次PCR和一次转化。其次，分裂标记设计有效解决了缺口修复背景转化的问题，这一策略对其他生物体中非适宜末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）介导的质粒重新环化与缺口修复竞争的问题具有借鉴意义。再次，split-bsdmx系统扩展了该方法的适用范围，使其不限于携带ura4-D18等位基因的实验室菌株，而可用于包括自然分离株在内的更广泛的菌株资源。
在应用价值方面，该方法为粟酒裂殖酵母的功能基因组学研究提供了更高效的工具，有利于加速基因功能分析和遗传学研究。此外，研究还意外发现缺口修复方法的转化效率比使用环状质粒高10倍以上，作者推测这可能是由于缺口修复需要时间来完成，延迟了sgRNA（可能还有Cas9）的表达，使细胞能够先从转化过程的压力中恢复。这一发现为提高CRISPR/Cas9系统的转化效率提供了新的思路。
五、研究的亮点
本研究的突出亮点包括：（1）首次在粟酒裂殖酵母中建立了基于缺口修复的无克隆CRISPR/Cas9基因组编辑方法；（2）创新性地采用分裂标记设计来消除背景转化，该设计具有普适性可移植到其他生物体系；（3）开发了双系统（split-ura4和split-bsdmx），增强了方法的灵活性和适用菌株范围；（4）系统地验证了该方法在多种基因组编辑类型（点突变敲入、N端标记、序列删除）中的有效性，并优化了关键实验参数。
此外，研究还揭示了一些实用的经验性发现，例如缺口修复方法的转化效率显著高于环状质粒方法、不同sgRNA的切割效率存在显著差异（“高on-target score”不一定意味着高编辑效率）、以及选择多个sgRNA靶序列有助于确保敲入成功等，这些经验对于实际应用具有重要的指导价值。