关于“Mitocytosis：一种由迁移体介导的线粒体质量控制过程”的研究报告

本研究由清华大学-北京大学联合生命科学研究中心、清华大学膜生物学国家重点实验室的焦海峰、蒋东、胡晓宇等研究人员，与清华大学医学院免疫学研究所及台湾彰化基督教医院线粒体医学与自由基研究中心等机构的科研人员共同完成。该研究于2021年5月27日发表在顶级学术期刊《细胞》（*Cell*）上。

一、 学术背景

线粒体是真核细胞进行能量代谢和信号转导的关键细胞器，其功能正常对于细胞稳态至关重要。细胞已进化出多种机制来维持线粒体质量，例如线粒体自噬（Mitophagy）、线粒体蛋白酶降解以及线粒体来源囊泡（Mitochondrial-Derived Vesicles, MDVs）的清除等。这些机制大多依赖于细胞内的降解系统。另一方面，细胞也能通过“排出”或“丢弃”的方式处理受损成分，例如神经元在应激下可排出蛋白质聚集体和线粒体。然而，对于高度迁移的细胞（如免疫细胞）而言，它们能量需求高、活性氧（ROS）产生多，线粒体承受的压力更大，是否存在一种与细胞迁移特性紧密耦合的、独特的线粒体质量控制机制，是一个重要的科学问题。

迁移体（Migrasome）是清华大学俞立教授团队于2015年发现的一种新型细胞器。当细胞迁移时，会在其后缘拉伸出收缩纤维（Retraction Fibers），迁移体就在这些纤维上形成并生长。细胞迁移离开后，收缩纤维断裂，迁移体被留在后方，可以释放其内含物，此前研究已发现其在斑马鱼胚胎发育中起信号传递作用。但迁移体是否对产生它的细胞自身（即自主性功能）有重要作用，尚不清楚。

基于此背景，本研究旨在探究迁移体是否参与线粒体质量控制，并揭示其具体的分子机制和生理功能。

二、 研究流程与实验方法

本研究是一个系统性的原创性研究，整合了细胞生物学、分子生物学、生物化学及活体成像等多种技术，流程严谨，层层递进。主要流程可分为以下几个部分：

1. 现象发现与模型建立： 研究人员首先在L929细胞（稳定表达标记迁移体的Tspan4-GFP和标记线粒体的MitoDsRed）中观察到，当用低剂量（2 µM）的线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理时，线粒体会进入迁移体。通过生化分离迁移体并进行蛋白质印迹（Western Blot）分析，证实了线粒体外膜、内膜和基质蛋白在CCCP处理后确实在迁移体中富集。透射电子显微镜（TEM）观察进一步确认，迁移体内含有具有典型线粒体嵴结构、但形态肿胀（提示受损）的小型线粒体。他们将这种线粒体进入迁移体并被细胞丢弃的过程命名为“线粒体胞吐”（Mitocytosis）。

2. 机制探究——线粒体如何被运送到迁移体： * 过程观察： 通过活细胞延时成像，研究人员描绘了线粒体胞吐的动态过程：在应激下，管状线粒体向外周大幅延伸，其尖端抵达质膜附近后，发生断裂，产生的片段被“困”在细胞外周。当细胞迁移离开时，这些外周线粒体片段被留在收缩纤维上并最终进入迁移体。 * 关键分子鉴定： 利用RNA干扰（RNAi）技术进行基因敲低，系统筛选了参与线粒体动力学的关键蛋白。结果发现： * 驱动蛋白KIF5B（外向马达蛋白）： 其敲低显著抑制了线粒体胞吐，导致线粒体网络收缩到核周区域，向外周运输的能力下降。 * 动力相关蛋白1（DRP1，介导线粒体分裂）： 其敲低也阻断了线粒体胞吐。 * 肌球蛋白19（MYO19，连接线粒体与肌动蛋白）： 其敲低同样抑制了线粒体胞吐。过表达MYO19或其运动缺陷但保留锚定功能的突变体（W140V）均能促进线粒体胞吐，提示MYO19主要起将线粒体锚定在质膜下皮层肌动蛋白网络的作用。 * 动力蛋白（Dynein，内向马达蛋白）： 有趣的是，敲低动力蛋白足以在无应激条件下触发线粒体胞吐，且此效应可被KIF5B、DRP1或MYO19的敲低所阻断，说明动力蛋白的缺失通过同一通路促进线粒体胞吐。 * 受损线粒体的“身份识别”与选择性外周定位： * 表型确认： 使用MitoSOX（标记高ROS线粒体）和TMRM（标记高线粒体膜电位MMP线粒体）染色，发现迁移体中的线粒体绝大多数是高ROS、低MMP的受损线粒体。三维共聚焦成像显示，CCCP处理后，受损线粒体主要聚集在细胞底部（靠近基底膜），而细胞中部的线粒体仍保持正常。 * 分子机制： 研究人员设计了一个精巧的体外线粒体“下拉”（Pull-down）实验。他们从对照或CCCP处理的细胞中分离线粒体，然后与表达KIF5B-GFP和mCherry-DYNLL1（动力蛋白轻链）的细胞裂解物（S-100胞质成分）共孵育。结果表明，来自CCCP处理细胞的线粒体（整体受损）招募KIF5B的能力增强，招募动力蛋白的能力减弱。为了更精确地比较受损与正常线粒体，他们用CCCP处理细胞后，分离线粒体并用TMRM染色，通过流式细胞分选术（FACS）分出高MMP和低MMP的群体，再进行上述下拉实验。结果显示，低MMP（受损）线粒体特异性减少了与动力蛋白的结合，而与KIF5B的结合在两组间无差异。这揭示了核心机制：受损线粒体通过“避免”与内向马达动力蛋白结合，同时（在整体应激下）增强与外向马达KIF5B的结合，从而被选择性运输至细胞外周，为进入迁移体创造条件。

3. 功能验证——线粒体胞吐的保护作用： * 细胞水平： 为了验证线粒体胞吐的生理意义，研究人员构建了能增强该过程的细胞模型：过表达Tspan4或Tspan9（促进迁移体形成）或敲低动力蛋白。这些操作均能保护细胞免受CCCP诱导的MMP丧失和呼吸功能（通过Seahorse分析耗氧率OCR）下降。而同时敲低KIF5B则消除了这种保护作用，证明保护效应确实依赖于线粒体胞吐过程。 * 巨噬细胞模型： 使用小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。发现抑制巨噬细胞迁移（通过亲水性表面处理）或利用CRISPR/Cas9技术敲除 Tspan9 基因（显著减少迁移体形成），都会导致巨噬细胞MMP下降。在 Tspan9 敲除巨噬细胞中回补Tspan9，只能在允许迁移体形成的表面上恢复MMP，而在抑制迁移的表面上则不能，表明Tspan9是通过影响迁移体形成/线粒体胞吐来维持线粒体质量的。

4. 生理意义——在体中性粒细胞研究： * 在体观察： 通过静脉注射PE标记的抗Ly-6G抗体，利用单光子转盘共聚焦显微镜对活体小鼠肝脏和脾脏表面血管进行成像，首次直接观察到循环中的中性粒细胞在体内产生大量含有线粒体的迁移体。从血液中分离的迁移体，约87%来源于中性粒细胞，TEM显示其中含有受损线粒体。 * 基因敲除模型： 比较 Tspan9 敲除小鼠与野生型小鼠的中性粒细胞。将分别标记的两种中性粒细胞混合后回输至野生型小鼠体内，活体成像显示 Tspan9 敲除中性粒细胞产生的迁移体显著减少。 * 功能后果： 从脾脏分离的中性粒细胞显示，Tspan9 敲除小鼠中有高MMP的中性粒细胞比例显著降低。然而，在骨髓（中性粒细胞生成和成熟部位，迁移活动少）中，两种基因型小鼠的中性粒细胞MMP无差异。这表明迁移体介导的质量控制发生在迁移过程中，而非Tspan9的细胞自主性功能。最后，通过CFSE标记竞争性回输实验发现，Tspan9 敲除中性粒细胞在循环中的存活数量低于野生型，证明线粒体胞吐对于维持中性粒细胞在体内的存活至关重要。

三、 主要研究结果

1. 发现线粒体胞吐现象： 多种温和的线粒体应激（如低剂量CCCP、抗霉素A、寡霉素、铁螯合剂去铁酮以及饥饿）均能诱导多种哺乳动物细胞将线粒体转运至迁移体并丢弃，该过程被命名为Mitocytosis。
2. 阐明分子机制： 线粒体胞吐依赖于一个精密的运输和锚定过程。受损线粒体通过减少与内向马达动力蛋白的结合，被KIF5B驱动的外向运输主导，定位到细胞外周。在外周，MYO19将线粒体锚定在皮层肌动网上，随后DRP1介导线粒体尖端发生分裂，最终这些被“困”在外周的线粒体片段随细胞迁移而被包裹进迁移体丢弃。
3. 证实选择性清除： 迁移体选择性包裹并清除的是受损（低MMP、高ROS）的线粒体。利用携带致病性mtDNA缺失突变的异质性细胞模型，证实了携带突变mtDNA的线粒体被特异性富集于迁移体中，证明了其“质检”的选择性。
4. 证明细胞保护功能： 在培养细胞中，增强线粒体胞吐（过表达Tspan4/9或敲低动力蛋白）能提升细胞在应激下的MMP和呼吸功能，并加速MMP恢复；反之，抑制该过程（敲低KIF5B或抑制迁移）则导致基础状态下MMP和呼吸功能下降。
5. 揭示在体生理功能： 首次在活体动物中证明，中性粒细胞通过迁移体进行线粒体胞吐。Tspan9 基因敲除导致小鼠中性粒细胞线粒体胞吐减少、线粒体质量下降（MMP降低），并最终损害中性粒细胞在循环中的存活能力。

四、 研究结论与意义

本研究首次发现并系统阐述了一种全新的、与细胞迁移过程偶联的线粒体质量控制机制——线粒体胞吐。该机制的核心在于，迁移细胞能够通过迁移体主动地将受损的线粒体“扔出”细胞外，从而维持细胞自身的线粒体健康。其科学价值在于： 1. 拓展了细胞器生物学和细胞质量控制的范畴： 将迁移体这一新细胞器的功能从细胞间通信拓展至细胞内稳态维持，揭示了细胞可以通过“排出”而非“降解”的方式处理受损组分。 2. 提出了细胞适应性的新范式： 研究提出了“线粒体胞吐与线粒体自噬构成应对不同强度线粒体压力的‘两档’系统”的观点。线粒体胞吐处理温和、生理性的损伤，而线粒体自噬应对严重、病理性的损伤。这为理解细胞如何动态适应不同压力环境提供了新视角。 3. 阐明了细胞迁移与代谢稳态的耦合机制： 迁移细胞能量需求高、ROS产生多，线粒体压力大。线粒体胞吐作为一种迁移依赖的机制，完美地将细胞的空间运动能力与其内部能量工厂的维护联系起来，具有重要的生理学意义。 4. 为免疫细胞功能研究提供新思路： 研究以中性粒细胞为模型，证明了该机制对于维持这类高迁移性免疫细胞的活力和功能至关重要，可能为理解免疫相关疾病或衰老过程中免疫细胞功能衰退提供新的机制解释。

五、 研究亮点

1. 概念原创性： 首次提出并定义了“Mitocytosis”（线粒体胞吐）这一全新的生物学过程，是细胞生物学领域的一项重要原创发现。
2. 机制阐释深入： 从现象到机制，完整揭示了从“线粒体受损”到“被迁移体丢弃”的全链条分子事件，特别是发现了受损线粒体通过“规避”内向马达实现选择性外周定位这一精巧的识别与运输逻辑。
3. 技术整合性强： 研究综合运用了高分辨率活细胞成像、超微结构电镜、生化分离、体外重构实验、基因编辑动物模型及高难度的活体显微成像技术，证据链完整，说服力强。
4. 生理相关性高： 不仅停留在细胞系水平，更通过构建基因敲除小鼠，在巨噬细胞和中性粒细胞等原代免疫细胞中验证了该机制的生理重要性，并将表型与细胞存活直接关联，凸显了其生物学意义。
5. 提出新模型： 将迁移体的功能从“信号发射器”扩展到“细胞垃圾处理器”，并提出了迁移细胞应对线粒体压力的“两档”质量控制模型，具有很高的理论价值。

六、 其他有价值的内容

研究在讨论部分也坦诚指出了当前工作的局限性，并提出了未来方向：例如，需在感染等病理模型中进一步验证线粒体胞吐在免疫应答中的作用；需拓展至其他迁移性免疫细胞；需寻找损伤线粒体发出“避免结合动力蛋白”信号的具体分子线索；以及探索线粒体胞吐是否也可能作为细胞间线粒体水平转移的一种途径。这些思考为后续研究指明了方向。