微藻介导的银纳米颗粒绿色合成：一种利用Graesiella emersonii KNua204胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）的可持续方法

本研究由Jeong-mi Do、Ji Won Hong和Ho-sung Yoon等人完成，研究机构隶属于韩国庆北国立大学（Kyungpook National University）的Integrated Blue Carbon Research Center、生物系及BK21 Four KNU Creative Bioresearch Group。该论文于2025年5月14日发表在期刊《Frontiers in Microbiology》上，文章类型为原创研究（original research）。

一、研究背景与目的

传统纳米颗粒合成依赖化学和物理方法，常涉及有毒试剂、高能耗和环境毒性。作为可持续替代方案，生物合成利用生物分子以环境友好的方式形成纳米颗粒。微藻因具有高光合效率、快速生物量积累和对多种培养条件的适应性，被视为可持续的“生物工厂”。其中，微藻分泌的胞外聚合物（EPS）是一类由多糖、蛋白质、脂质和糖醛酸组成的高分子量生物聚合物，在生物膜形成、细胞保护、重金属螯合及纳米材料合成中发挥关键作用。银纳米颗粒（AgNPs）因其抗菌、抗炎和催化活性在生物医学和环境领域具有广泛应用前景，但传统合成方法存在环境和健康风险。利用微藻EPS作为天然还原剂和稳定剂进行AgNPs绿色合成具有重要研究价值。本研究旨在利用微藻Graesiella emersonii KNua204分泌的EPS实现AgNPs的绿色合成，并系统考察培养时间、pH及四环素（tetracycline）作为辅助稳定剂对合成过程的影响，同时对所得AgNPs和四环素辅助AgNPs（tetra-AgNPs）进行理化表征和生物活性评价。

二、研究流程与实验方法

本研究主要包括以下环节：微藻分离与鉴定、微藻培养与EPS提取、EPS生化组成分析、AgNPs与tetra-AgNPs的生物合成、纳米颗粒的物理化学表征以及功能与抗菌性能评价。

首先，研究人员从韩国郁陵岛采集淡水样品，接种于BG-11培养基中，在25°C、16:8小时光暗周期、135 µmol m⁻² s⁻¹光照强度下以160 rpm振荡培养。通过平板划线法获得无菌纯培养，并利用光学显微镜观察细胞形态。物种鉴定通过提取基因组DNA，PCR扩增18S rRNA和内部转录间隔区（ITS）序列，使用NCBI BLAST进行比对，并用MEGA X软件构建系统发育树。结果显示18S rRNA和ITS序列与G. emersonii CCAP 211/11N和CCAP 211/8H分别有99.83%和100%的匹配度，确认该分离株为G. emersonii KNua204。

在微藻培养与EPS提取环节，将微藻接种于100 mL BG-11培养基中（初始OD600为0.01），在相同条件下培养至稳定期，离心（1,516×g）后取上清液，按照Trabelsi等人（2016）的方法提取EPS。EPS生化组成分析包括：总碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法测定；单糖组成参照NREL实验室分析程序，通过高效液相色谱（HPLC）配以示差折光检测器分析；糖醛酸含量采用咔唑法测定；总蛋白含量采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品；硫酸盐含量采用BaCl₂-明胶法测定。结果表明，碳水化合物占EPS总量的49.56±0.72%，蛋白质占12.54±1.25%，硫酸盐占11.81±0.16%，糖醛酸占13.14±1.22%。单糖组成分析中，半乳糖占总糖含量的14.89±0.70%，另有两种未鉴定单糖分别占79.08±3.69%和6.02±4.30%。

AgNPs的生物合成是本研究的核心环节。将稳定期培养物离心获得上清液，加入AgNO₃溶液至终浓度0.5 mM，分别在光照（40.5 µmol m⁻² s⁻¹）和黑暗条件下于25°C、160 rpm振荡孵育。通过可见颜色变化（由透明变为浅棕色或深棕色）和紫外-可见光谱（UV-Vis）确认AgNPs合成。对于tetra-AgNPs的合成，在反应体系中加入不同浓度四环素（10、20、30、40和50 µg mL⁻¹）。同时考察pH（5至10）对合成的影响。需要强调的是，该方法无需对微藻生物质进行预处理，直接利用含EPS的上清液即可实现AgNPs合成，具有显著的资源节约优势。

物理化学表征包括：利用X射线衍射（XRD）分析晶体结构，扫描范围为2θ 0°至80°，使用Cu Kα辐射；利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）在4,000–400 cm⁻¹范围内分析官能团；利用透射电子显微镜（TEM）观察形貌，并用ImageJ软件分析粒径分布；利用能量色散X射线光谱（EDX）分析元素组成；利用Zetasizer Nano ZS测定zeta电位和水动力尺寸分布。此外，利用电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）定量分析细菌细胞内纳米颗粒的摄取量。

生物活性评价包括DPPH自由基清除实验测定抗氧化活性，以抗坏血酸为阳性对照，样品浓度范围0.3–10 µg mL⁻¹。抗菌活性采用纸片扩散法和液体培养法评价，针对四种来自韩国典型菌种保藏中心（KCTC）的菌株：Bacillus spizizenii KCTC 2023、Bacillus cereus KCTC 3062、Staphylococcus pasteuri KCTC 13173和Escherichia coli KCTC 2571。纸片扩散法中，6 mm无菌纸片含1–10 mg mL⁻¹抗菌剂，培养过夜后测量抑菌圈直径。液体培养法中，在LB培养基中加入不同浓度抗菌剂（0、2.5、5和10 µg mL⁻¹），37°C振荡培养过夜，测定OD600计算杀菌率。

三、主要研究结果

在AgNPs生物合成方面，光照条件下，G. emersonii KNua204上清液与AgNO₃的混合物在数小时内出现由透明到棕色的颜色变化，UV-Vis光谱在约400 nm处出现吸收峰，证实AgNPs成功合成。而黑暗条件下未观察到AgNPs合成；仅含BG-11培养基和AgNO₃的对照组在光照或黑暗下均无颜色变化和特征吸收峰，证明微藻上清液是纳米颗粒形成的必要条件。延长光照时间导致吸光度值升高，表明纳米颗粒浓度增加。培养时间对合成有显著影响：使用14天、21天和28天培养上清液合成的AgNPs，其28天样品呈现更窄的吸收光谱和轻微红移的最大吸收峰，表明粒径增大。上清液pH分别为10.11、10.33和9.81，碱性条件（pH 10–11）有利于合成；酸化导致吸收峰蓝移并保持棕色，碱化导致红移和深棕色。四环素的加入在光照3小时后使反应混合物颜色强度明显高于对照组，UV-Vis吸光度值更高。在黑暗条件下，四环素的添加虽然不能完全替代光照，但确实实现了AgNPs的合成，其中30、40和50 µg mL⁻¹四环素浓度下的最大吸光度值在光照和黑暗条件下高度一致。光照条件下，吸收峰随时间发生蓝移；而黑暗条件下未观察到显著峰位移动。

在物理化学表征方面，TEM分析证实AgNPs和tetra-AgNPs均为球形，粒径分布范围4–35.02 nm，平均直径分别为15.40±5.07 nm和17.15±5.35 nm。EDX分析显示银（Ag）为主要元素，在AgNPs和tetra-AgNPs中的相对含量分别为29.92%和66.60%。选区电子衍射（SAED）图案呈现明亮同心环，表明两种AgNPs均为多晶结构。XRD分析鉴定出四个主要衍射峰，分别对应银的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，其中(111)面为主导取向；AgNPs还显示出tetra-AgNPs中不存在的额外小峰，暗示两者之间存在结构差异。两种纳米颗粒的优先晶面间距均为0.246 nm，与银的(111)面一致。FTIR分析显示EPS、AgNPs和tetra-AgNPs分别呈现11、9和9个特征峰。EPS中3,431 cm⁻¹处的O-H和N-H伸缩振动峰在两种AgNPs中移至3,434 cm⁻¹，表明与AgNPs存在相互作用。EPS中1,154 cm⁻¹处的O-H峰在两种AgNPs中均消失，表明羟基参与了AgNP还原。1,063 cm⁻¹（EPS）、1,037 cm⁻¹（AgNPs）和1,050 cm⁻¹（tetra-AgNPs）处的峰对应C-O伸缩振动，进一步证实多糖在稳定过程中发挥作用。Zeta电位测定显示，光照条件下不同四环素浓度（0–50 µg mL⁻¹）合成的AgNPs的zeta电位值在−21.50±0.99至−24.87±2.19 mV之间，黑暗条件下在−21.03±0.33至−27.97±8.02 mV之间，表明四环素未显著改变AgNPs表面电荷，所有条件下纳米颗粒均保持中等胶体稳定性。

生物活性评价结果方面，DPPH实验显示AgNPs和tetra-AgNPs均表现出约60%的自由基清除效率，但未超过阳性对照抗坏血酸。抗菌实验方面，纸片扩散法中B. spizizenii对AgNPs和tetra-AgNPs的敏感性最高，形成最大抑菌圈；而B. cereus、S. pasteuri和E. coli的抑菌圈相对较小。液体培养实验中，2.5和5 µg mL⁻¹浓度下细菌生长未受显著抑制，但10 µg mL⁻¹浓度下两种AgNPs对所有四种细菌均表现出约100%的杀菌活性，呈现剂量依赖性抗菌效果。ICP-OES分析显示，B. cereus、S. pasteuri和E. coli中纳米颗粒的细胞内浓度高于B. spizizenii，表明纳米颗粒摄取效率存在物种依赖性。值得注意的是，tetra-AgNPs并未表现出优于AgNPs或单独四环素的抗菌效果，推测四环素分子可能通过非共价键吸附于纳米颗粒表面而非形成核壳包封，其A环（对细菌核糖体结合至关重要的结构）在tetra-AgNPs中未能充分暴露，从而降低了其抗菌效能。

四、结论与研究价值

本研究证明G. emersonii KNua204分泌的EPS能够在无生物质预处理条件下实现AgNPs的绿色合成，最佳pH为10–11，培养时间延长有利于提高EPS浓度和纳米颗粒稳定性。四环素在黑暗条件下可加速AgNPs形成，但不能替代光驱动的电子转移过程。所合成的AgNPs和tetra-AgNPs均为晶体、球形且具有中等稳定性，在10 µg mL⁻¹浓度下表现出强抗菌活性。该研究的主要价值在于：其一，提供了一种细胞外、无预处理、资源节约型的AgNPs合成策略，使微藻生物质可同时用于生物燃料生产和高价值纳米材料合成，符合生物炼制理念；其二，利用微藻上清液进行纳米材料生产，无需破坏细胞，为微藻生物质的双重利用提供了新思路；其三，系统探讨了四环素辅助合成对纳米颗粒理化性质和生物活性的影响，为抗生素功能化纳米颗粒的设计提供了重要参考，即化学稳定性与生物活性之间的平衡需要谨慎权衡。

五、研究亮点

本研究的创新性主要体现在以下方面：首先，传统微藻介导的纳米颗粒合成多依赖收获后的生物质，需要煮沸、均质和提取等预处理步骤，而本研究直接利用含EPS的上清液进行AgNPs合成，大幅简化了工艺并提高了资源利用效率。其次，G. emersonii KNua204能够在废水和蚯蚓堆肥处理水中生长，同时具有脂质积累能力，因此该菌株在生物能源与纳米材料联产方面具有独特优势。第三，对四环素在光照和黑暗条件下的辅助合成作用进行了系统性时间进程分析，揭示了光驱动电子转移在EPS介导合成中的不可替代性，为理解生物合成机制提供了实验依据。第四，该研究将微藻EPS的生化组成（尤其是糖醛酸和未鉴定单糖）与纳米颗粒合成能力相关联，提示EPS中阴离子基团在金属结合和纳米颗粒稳定中的关键作用，为未来定向优化EPS组成提供了线索。