主要作者与发表信息
本研究由Hadar Bootz-Maoz、Ariel Simon、Sara Del Mare-Roumani、Yifat Bennet、Einat Toister、Hadar Romano、Danping Zheng、Sivan Amidror、Eran Elinav以及Nissan Yissachar等人共同完成。其中，第一作者Hadar Bootz-Maoz和通讯作者Nissan Yissachar来自以色列巴伊兰大学（Bar-Ilan University）生命科学学院及纳米技术与先进材料研究所，Eran Elinav则来自以色列魏茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）和德国癌症研究中心（DKFZ）。该研究于2023年发表在期刊《npj Biofilms and Microbiomes》上，论文标题为“Ex vivo intestinal permeability assay (x-IPA) for tracking barrier function dynamics”，文章编号为9:44。
学术背景
本研究属于宿主-微生物互作、肠道黏膜免疫及屏障功能研究领域。肠道上皮屏障由单层肠上皮细胞构成，其完整性依赖于Lgr5+肠道干细胞的持续更新以及细胞间紧密连接蛋白的物理加固。当屏障受损时，肠腔内的微生物及有害分子可易位至组织乃至远端器官，引发炎症反应。肠道屏障功能异常与炎症性肠病、肠易激综合征、过敏、自身免疫病甚至癌症等多种疾病密切相关。然而，传统的研究手段如跨上皮电阻、尤斯灌流室和体内灌胃荧光示踪剂等，难以在完整组织水平实现对屏障动态的实时、高时间分辨率监测。研究团队此前已建立了一种肠道器官培养系统，能够维持离体肠道组织的原始结构并实现对宿主-微生物互作的精细操控。基于此，本研究的核心目标是将该器官培养系统的优势进一步拓展，开发并优化一种能够在多段肠道组织中、在严格控制条件下、以高时间分辨率定量检测肠腔刺激引起的快速且细微的通透性变化的方法，即离体肠道通透性检测（x-IPA），以填补体外简化模型与体内复杂动物模型之间的技术空白。
研究详细流程
本研究的技术核心是x-IPA系统的建立与验证，其工作流程涵盖系统搭建、可行性验证、动态成像分析、代谢物与微生物应用等多个环节。
首先，研究团队在原有肠道器官培养装置的基础上，将碳黑掺入PDMS中制造出黑色不透明培养装置，以减少背景荧光干扰。取14日龄SPF级C57BL/6小鼠的完整结肠或回肠，无菌冲洗肠腔内容物后，将肠段两端固定在培养装置的输入和输出端口上。培养装置置于37°C恒温培养箱中，组织半浸泡于无酚红、无血清的IMDM培养基中。通过注射泵将含有FITC-葡聚糖（4 kDa，0.5 mg/ml）的培养基直接灌注至肠腔内。若上皮屏障完整，FITC-葡聚糖被限制在肠腔内；屏障受损时，该分子则渗漏至肠腔外的培养基中。通过测量肠腔外培养基的荧光强度，即可定量评估上皮屏障的通透性。实验终点时，使用荧光计测定肠外培养基荧光值；同时，在培养装置上方安置三台Dino-Lite荧光数码显微镜，每台相机拍摄两个培养腔室，以5分钟（2小时实验）、10分钟（4小时实验）或15分钟（8小时实验）的间隔连续采集延时影像，实时记录FITC-葡聚糖向肠腔外扩散的动态过程。为自动化定量分析延时影像，团队自主开发了基于MATLAB的图像分析软件x-IPA Analyzer，并配有用户友好的图形界面。该软件包含图像预处理、组织自动分割和肠腔外培养基绿色荧光强度定量等功能：首先手动裁剪出包含肠组织和外部培养基的测量区域，然后提取绿色通道并使用高斯滤波降噪，接着采用Otsu自动阈值分割方法将组织与培养基区域分离，并将组织分割区域向外扩展8像素以避免边缘效应，最后计算每帧图像中培养基区域的平均荧光强度，生成随时间变化的平均荧光强度曲线。这一自研软件为高通量、客观、可比的通透性动态分析提供了关键工具。
在验证与功能测试环节，研究团队进行了系统性的实验。首先验证了EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，一种钙离子螯合剂，可破坏紧密连接完整性）诱导的屏障损伤效应。利用动态TEER检测和Caco-2细胞单层ZO-1染色确认EGTA的作用后，向离体结肠肠腔内单独灌流FITC-葡聚糖（4 kDa）或同时加入EGTA（25 mM）。结果显示，EGTA灌注显著降低了结肠组织中ZO-1紧密连接蛋白的表达，并导致肠外培养基中FITC-葡聚糖荧光强度在2小时和8小时时均显著升高。为进一步区分EGTA引起的是紧密连接控制的细胞旁通透性增加（仅允许小分子通过）还是非特异性上皮损伤（允许任何大小分子通过），研究使用了70 kDa的FITC-葡聚糖，该大分子仅在屏障出现不受限破坏时方可穿过。结果发现EGTA并未引起70 kDa大分子的肠外渗漏，证明x-IPA系统能够检测到由紧密连接调控的细胞旁通透性变化，而非组织坏死导致的非特异性渗漏，从而保证了系统对功能性屏障动态的特异性。此外，团队还利用延时成像和x-IPA Analyzer对EGTA灌注的小肠器官培养物以及乙醇（5%）处理的结肠培养物进行了动态监测，均观察到快速且显著的通透性增加，其中EGTA处理组的斜率（0.75）高于对照组（0.17）。同时，通过分析FITC-葡聚糖沿肠段的空间分布，排除了输入端或输出端渗漏的干扰。终点荧光计读数与图像平均荧光强度高度相关（R²=0.9822），进一步验证了成像分析方法的可靠性。
随后，研究团队探索了x-IPA系统在肠道代谢物和特定肠道微生物研究中的应用。将腐胺（一种由肠道微生物产生的多胺类化合物，此前被证实为屏障破坏因子）以不同浓度（33、66、100 mM）灌流至结肠器官培养物。结果显示，腐胺引起的通透性增加呈剂量依赖性：4小时时，66 mM和100 mM腐胺组的肠外荧光强度显著高于对照组，且斜率随浓度升高而增大。延时影像分析显示FITC-葡聚糖扩散速率随腐胺浓度增加而逐渐加快，提示紧密连接的开放可能是一个由肠腔信号强度线性调节的连续过程。在微生物实验中，研究比较了具有屏障破坏作用的厌氧人共生菌Bifidobacterium adolescentis和不破坏屏障的Bacteroides fragilis。向结肠器官培养物肠腔内灌流等量细菌后，仅B. adolescentis在4小时时引起肠外荧光强度显著增加，B. fragilis组与对照组无差异。延时分析同样证实B. adolescentis灌流后肠外平均荧光强度快速上升（斜率0.22），而B. fragilis组斜率接近零。团队进一步用Enterococcus gallinarum（屏障破坏菌）和Bacteroides acidifaciens（非破坏菌）在体外TEER实验和x-IPA体系中进行了平行验证，两种方法结果一致。
主要结果与逻辑关系
本研究的主要结果是成功建立并验证了x-IPA系统，证明其能够在完整组织水平以高时间分辨率实时追踪肠道通透性的动态变化。其根本原理是：FITC-葡聚糖从肠腔向肠外培养基的迁移速率直接反映上皮屏障的完整性；荧光强度越高，表示通透性越大。与现有方法相比，x-IPA的关键优势体现在三个方面：一是以完整肠段为研究对象，保留了原始组织结构、细胞多样性和生理空间背景；二是通过延时成像与自研图像分析软件，实现了对同一组织连续、实时的通透性监测，获得动态速率参数而非仅仅是终点数据；三是能够同时处理多个组织样本（每个装置六个腔室），支持高通量的平行比较。这些技术特征使得x-IPA能够检测到传统方法难以捕捉的快速且细微的屏障变化。研究通过一系列验证实验逐步构建了证据链：首先以EGTA作为阳性破坏剂，在蛋白表达水平（ZO-1减少）和功能水平（4 kDa分子渗漏增加）同时证实了系统检测能力；接着使用70 kDa大分子排除了非特异性损伤的干扰，明确该系统反映的是紧密连接调控的细胞旁通透性；然后利用腐胺和B. adolescentis等具有生物学相关性的刺激物，展示了系统在代谢物浓度梯度和微生物特异性屏障效应研究中的适用性，且结果与既往体外TEER研究及RNA测序发现相互印证。这些结果共同支持了研究结论：x-IPA能够特异、动态、定量地反映紧密连接依赖的肠道屏障功能变化，可用于解析微生物和代谢物对屏障的快速调节机制。
结论与价值
本研究成功开发并优化了一种名为x-IPA的离体肠道通透性检测方法。该方法将肠道器官培养系统与荧光分子（FITC-葡聚糖）灌流、实时荧光成像及自动化图像分析相结合，能够在保留完整组织结构的条件下，以分钟级时间分辨率动态追踪肠道屏障通透性的变化。其科学价值在于：为研究宿主-微生物互作中肠道屏障的快速动力学提供了全新工具，弥合了简化体外细胞模型（无法反映组织复杂性）与体内动物模型（难以进行实时动态监测和严格控制肠腔刺激）之间的鸿沟。应用价值方面，x-IPA可以系统评估微生物菌株、代谢物、药物或其他肠腔因素对屏障功能的调节作用及其剂量-时间依赖关系，有助于筛选和解析屏障调控因子，为以肠道屏障为靶点的治疗策略开发提供临床前研究平台。论文还指出，x-IPA可与后续的组织测序、细胞分选及成像技术结合，实现动态通透性数据与分子机制研究的整合，进一步推动宿主-微生物互作领域的机制探索和转化研究。
研究亮点
本研究的突出亮点包括：其一，方法学创新，首次将离体肠道器官培养与实时荧光成像及自研MATLAB分析软件集成，构建了可动态追踪完整肠段屏障功能的x-IPA系统。其二，系统验证严谨，通过使用不同分子量FITC-葡聚糖，成功区分了紧密连接调控的细胞旁通路与非特异性损伤通路，保证了检测的特异性。其三，应用范围广泛且生物学意义明确，不仅验证了化学破坏剂，还展示了该方法对肠道代谢物（腐胺）的剂量依赖性响应及对不同肠道共生菌（B. adolescentis与B. fragilis；E. gallinarum与B. acidifaciens）的特异性区分能力，为研究微生物及其代谢产物对肠道屏障的实时调控提供了直接证据。此外，论文公开了x-IPA Analyzer软件及用户手册，增强了方法的可及性和可重复性。