基于碱基编辑技术创制水稻蜡质基因新等位基因以改良稻米品质的研究报告

一、研究团队与发表信息
本研究由Xiaorui Huang（山东师范大学）、Fei Su（山东师范大学/Bellagen生物技术有限公司）、Sheng Huang（山东师范大学/Bellagen生物技术有限公司）等共同完成，通讯作者为Jinshan Zhang（山东师范大学/Bellagen生物技术有限公司）。合作单位包括上海师范大学、中国科学院分子植物科学卓越创新中心。研究成果发表于2021年9月的《Journal of Integrative Plant Biology》（JIPB），标题为《Novel wx alleles generated by base editing for improvement of rice grain quality》。

二、学术背景
科学领域：本研究属于植物分子育种与作物品质改良领域，聚焦水稻淀粉合成的遗传调控机制。
研究动机：直链淀粉含量（Amylose Content, AC）是决定稻米食味与蒸煮品质（Eating and Cooking Quality, ECQ）的关键指标，由蜡质基因（Waxy, *Wx*）编码的颗粒结合淀粉合成酶I（GBSSI）调控。尽管已知*Wx*基因N端结构域的突变可显著影响AC，但其中间区域的遗传变异对AC的作用尚不明确。
研究目标：利用腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE），在水稻*Wx*基因中间区域引入精准核苷酸替换，创制新等位基因，系统解析其对AC的调控作用，并筛选兼具优良ECQ与农艺性状的育种材料。

三、研究流程与方法
1. 靶点设计与载体构建
- 靶点选择：针对水稻品种“秀水134”（含*Wxb*等位基因）的*Wx*基因第7、10外显子设计10个sgRNA（靶向NG PAM序列），其中5个靶点（BE1/2/3/5/10）用于ABE编辑，5个（BE4/6/7/8/9）用于CBE编辑。
- 载体开发：使用SpCas9-NG变体（识别NG PAM）构建ABEmax-NCas9ng和ANC689BE4max-NCas9ng编辑器，显著扩展了可编辑位点范围。

1. 遗传转化与突变体筛选

   • 转化效率：通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，获得448株T0代再生植株，编辑效率最高达68.63%（ABE10）和66.67%（CBE7）。
     
   • 突变类型：Sanger测序鉴定出18种核苷酸替换，导致GBSSI蛋白15个氨基酸残基改变，包括错义突变（如T237A、H236R）和无义突变（如E410K）。
     

2. 表型分析与功能验证

   • AC测定：T2代纯合株系中，AC范围从0.3%（糯稻水平，*waxycbe8.2*）至29.43%（高抗性淀粉，*waxyabe10.1*），野生型为19.87%。关键突变体*waxyabe2*（T237A）的AC为13.72%，与优质“软米”品种南粳9108（10.99%）相近。
     
   • 碘染色与显微结构：*waxyabe2*胚乳碘染呈中间色（介于野生型深蓝与糯稻红棕之间），扫描电镜显示其淀粉颗粒形态规则，无糯稻特有的不规则孔洞。
     
   • 品质检测：快速粘度分析（RVA）表明*waxyabe2*具有高崩解值（2155 cP）和低回生值（−1177 cP），预示优良ECQ；凝胶稠度（GC）适中，透明度与野生型相当。
     

3. 脱靶分析与育种应用

   • 安全性验证：针对BE2/BE9 sgRNA的26个潜在脱靶位点测序未检测到突变。
     
   • 无转基因株系选育：通过特异性引物筛选获得5株不含外源DNA的*waxyabe2*后代，可直接用于育种。
     

四、主要研究结果
1. 新等位基因的创制：首次在*Wx*基因中间区域实现精准编辑，获得18个新等位基因，其中*wxyabe2*（T237A）和*wxycbe9.1*（E411K）分别代表“软米”和“糯稻”表型。
2. AC调控机制：发现GBSSI中间区域（如236、237、410位点）的氨基酸替换可显著降低酶活性，而253、427位点突变则提高AC，揭示了该区域对淀粉合成的精细调控作用。
3. 育种价值：*waxyabe2*在保持野生型农艺性状（株高、产量、籽粒形态）的同时，兼具低AC、高透明度和优良RVA特性，突破了传统低AC品种往往伴随农艺缺陷的瓶颈。

五、结论与意义
科学价值：
- 拓展了*Wx*基因功能域认知，证明其中间区域突变可独立调控AC，为淀粉合成机制研究提供新视角。
- 建立了基于NG PAM的ABE/CBE多靶点编辑体系，为作物精准育种提供技术范式。

应用价值：
- *waxyabe2*无需外源基因整合即可实现品质改良，符合商业化育种需求。
- 系列等位基因（AC 0.3%–29.43%）可满足多样化市场需求，如低AC软米、高抗性淀粉健康食品等。

六、研究亮点
1. 方法创新：首次将SpCas9-NG与碱基编辑联用，突破传统NGG PAM限制，编辑效率达68.63%。
2. 发现新颖性：揭示了GBSSI中间区域对AC的调控作用，创制的*wxyabe2*等位基因为国际首报。
3. 应用潜力：全流程展示从基因编辑到育种材料开发的转化研究，为作物品质改良提供可复制方案。

七、其他价值
研究还发现高AC突变体（如*wxyabe10.1*）可能富含抗性淀粉，为功能性稻米开发提供材料基础。数据公开方面，所有sgRNA靶序列、引物信息及脱靶检测结果均以附表形式完整呈现（Supplementary Tables S1–S5），兼具可重复性与透明度。