Daniel I. Arnon 在 Plant Physiology 期刊1949年1月第24卷第1期上发表了一篇题为“Copper Enzymes in Isolated Chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris”（分离叶绿体中的铜酶：甜菜叶中的多酚氧化酶）的原创研究论文。作者单位标注为英国剑桥大学John Simon Guggenheim Memorial Foundation研究员，永久通讯地址为加州大学伯克利分校植物营养系。该研究属于植物生物化学与细胞器酶学领域，核心目的是探究分离叶绿体中是否存在能够参与氧化还原反应的酶类，尤其是多酚氧化酶（polyphenoloxidase，又称酪氨酸酶tyrosinase或儿茶酚酶catecholase）是否定位于叶绿体。这一研究背景建立在Hill等人发现离体叶绿体在光照和适宜氧化剂存在下能够释放氧气的基础上，因此探索叶绿体的酶组成对理解光合作用相关生化反应具有重要价值。

研究以甜菜叶（spinach beet, *Beta vulgaris*）为材料，采用分部离心技术分离叶绿体碎片与细胞质流体。叶片首先经清洗、冷却后手工撕碎，在Waring捣碎机中与M/15磷酸钾缓冲液或玻璃蒸馏水一起研磨。匀浆经纱布和棉花过滤后，先进行约3000转/分钟的短时间离心以去除完整叶绿体和较大颗粒，上清液再在约25000 g下离心20分钟。离心后得到沉淀为叶绿体碎片悬浮液，上清液为几乎不含叶绿素的细胞质流体。叶绿素浓度根据Mackinney的80%丙酮提取物在663 nm和645 nm处的吸光度，用特定吸收系数计算。多酚氧化酶活性通过瓦氏呼吸计在20°C下以儿茶酚（catechol）为催化剂、抗坏血酸（ascorbic acid）为底物进行测定。该方法的原理是：多酚氧化酶不能直接氧化抗坏血酸，但儿茶酚可被酶氧化为邻醌（o-quinone），邻醌又迅速被抗坏血酸还原回儿茶酚，因此氧气消耗反映了抗坏血酸的氧化过程。反应体系中加入少量儿茶酚和1.2至2.4毫克抗坏血酸，总体积为3毫升，中央小井用KOH吸收CO₂。该研究还测定了氰化物、一氧化碳、二乙基二硫代氨基甲酸钠（sodium diethyldithiocarbamate）等抑制剂对酶活性的影响，以及不同提取pH和进一步机械破碎对多酚氧化酶定位的影响。

研究结果首先显示，在甜菜叶粗提物中加入儿茶酚可显著促进氧气吸收，说明叶片中存在多酚氧化酶活性。进一步将叶绿体碎片与细胞质流体分离后，多酚氧化酶活性几乎全部出现在叶绿体悬浮液中。叶绿体悬浮液在加入儿茶酚和抗坏血酸后表现出快速氧气吸收，而仅加抗坏血酸或仅加儿茶酚时氧气吸收明显降低；细胞质流体无论加入抗坏血酸、儿茶酚还是两者组合，氧气吸收均无明显增加。抑制剂实验显示，氰化物在4.6×10⁻⁵ M时即可抑制叶绿体悬浮液的多酚氧化酶活性，10⁻⁴ M和4.6×10⁻⁴ M时抑制更强；二乙基二硫代氨基甲酸盐在10⁻⁴ M、5×10⁻⁴ M和10⁻³ M下也呈浓度依赖性抑制；一氧化碳在90% CO–10% O₂气氛中显著抑制酶活性，但光照不能逆转该抑制作用。这些结果符合多酚氧化酶作为铜蛋白的性质，也排除了漆酶（laccase）参与的可能性，因为漆酶不被一氧化碳抑制。

为了排除多酚氧化酶定位于叶绿体是制备技术造成的假象，作者进行了三组验证实验。第一，向甜菜叶粗提物中加入马铃薯多酚氧化酶，再按原流程分离叶绿体碎片，结果发现加入的马铃薯酶仍保留在细胞质流体中，而叶绿体悬浮液的酶活性未增强，说明高速离心不会使游离的多酚氧化酶沉淀到叶绿体部分。第二，将提取和重悬缓冲液的pH从6.5改为更碱性的7.3，结果多酚氧化酶仍定位于叶绿体悬浮液，表明该定位不受提取pH影响。第三，将已经制备的叶绿体碎片用Mickle组织破碎机与玻璃珠进一步研磨，再进行高速离心分离，结果显示酶活性仍保留在叶绿体悬浮液中，未释放到细胞质流体中，说明进一步的机械破碎也不能使酶从叶绿体中脱落。此外，对叶绿体悬浮液和细胞质流体进行漆酶活性测试，以对苯二胺（p-phenylene diamine）为底物，未观察到氧气吸收增加，进一步证明所测酶活性来自多酚氧化酶而非漆酶。

基于以上结果，作者得出结论：甜菜叶中的多酚氧化酶定位于叶绿体，而非细胞质。该结论得到了不同提取pH、额外添加外源多酚氧化酶以及进一步破碎叶绿体三种实验的验证。该研究的意义在于，多酚氧化酶作为一种铜蛋白氧化酶，被发现集中于与光合作用密切相关的细胞器叶绿体中，这引发了关于该酶是否直接或间接参与光合作用相关生化反应的问题。尽管该研究未能直接证明多酚氧化酶在光合作用中的具体功能，但它为后续探索叶绿体铜酶在光合成氧和细胞氧化还原代谢中的作用提供了重要线索。同时，作者也指出，多酚氧化酶并非在植物界普遍存在，因为在许多单子叶和双子叶植物中并不含有该酶，因此对含有该酶的植物进行研究有助于推进比较生物化学的发展。

该研究的亮点包括：首次通过分部离心和多种验证实验明确证明多酚氧化酶定位于甜菜叶叶绿体；采用了儿茶酚作为抗坏血酸氧化的催化剂来间接测定多酚氧化酶活性，避免了高浓度邻醌的毒性；通过外源酶添加、pH变化和机械破碎三个维度的控制实验排除了制备过程造成的定位假象；并结合抑制剂实验确认了该酶为铜蛋白性质的氧化酶。此外，该研究还区分了多酚氧化酶与漆酶的活性特征，进一步增强了结论的可靠性。这些方法和结论为后来研究植物叶绿体酶学及光合作用相关氧化还原酶提供了重要的实验范例和理论依据。