本文是发表在《Biochemistry (Moscow)》2018年第83卷第10期上的一篇综述，题为《ADP-inhibition of H+-FOF1-ATP synthase》，作者为A. S. Lapashina和B. A. Feniouk，均来自Lomonosov Moscow State University（莫斯科国立大学）的生物工程与生物信息学系以及A. N. Belozersky物理化学生物学研究所。文章系统回顾了H+-FOF1-ATP合酶（H+-FOF1-ATP synthase）中ADP抑制（ADP-inhibition）现象的研究历史、分子机制、调控网络及其在不同物种中的生理意义。
FOF1-ATP合酶（FOF1-ATP synthase，又称F-ATPase、F型ATP酶、线粒体复合物V）是一类多亚基膜蛋白，广泛存在于真细菌、线粒体内膜、叶绿体类囊体膜以及少数古菌中。该酶的核心功能是利用跨膜质子电化学势差（Δμ̃H+，即质子动势，proton motive force, PMF）驱动ADP与无机磷酸合成ATP；当PMF下降或缺失时，该酶可逆向催化ATP水解并作为质子泵维持膜能化状态。由于FOF1在细胞膜蛋白中占比高、水解ATP速率可达数百至数千分子每秒，因此其ATP酶（ATPase）活性受到严格调控，以免在膜去能化或细胞缺氧时无谓消耗ATP。ADP抑制是最保守的调控机制之一，表现为MgADP复合物非竞争性抑制ATP水解活性：当ADP在无磷酸根的情况下结合于催化位点并发生构象锁定，酶即进入失活态；PMF可诱导抑制性ADP释放并重新激活酶，但所需阈值PMF甚至可能高于ATP合成所需值。
文章首先梳理了ADP抑制在叶绿体、细菌和线粒体FOF1中的发现历程。1972年在莴苣叶绿体中首次观察到ADP加速光照后ATPase活性衰减，而磷酸根能够拮抗这一效应；后续在豌豆和菠菜叶绿体F1中证实MgADP以非竞争性方式抑制ATP水解。光合细菌如Rhodobacter capsulatus和Rhodospirillum rubrum的亚细菌膜颗粒实验也揭示了PMF激活ATPase活性、ADP加速抑制、磷酸根稳定活性态的现象。蓝细菌如Synechococcus 6716的酶缺乏叶绿体γ亚基氧化还原调控所需的调节性半胱氨酸，但其ADP抑制特征与叶绿体酶相似。非光合细菌中，Micrococcus luteus、嗜热芽孢杆菌Bacillus sp. PS3以及Paracoccus denitrificans的FOF1亦表现出明显的ADP抑制。线粒体方面，1971年Mitchell和Moyle发现含氧阴离子可激活大鼠肝亚线粒体颗粒的ATPase活性，随后Vinogradov等通过牛心亚线粒体颗粒和纯化线粒体F1明确MgADP是抑制因子，并发现叠氮化物仅能抑制已进入ADP抑制态的酶，而亚硫酸盐则可激活该部分酶分子。
在分子机制层面，文章指出ADP抑制的关键在于催化位点在无磷酸根时结合ADP并经历构象变化将其锁定。若干氨基酸残基与ADP抑制密切相关，例如Bacillus sp. PS3的β亚基P-loop中βS165（对应叶绿体βT168、大肠杆菌βT168、酵母βT168）突变能显著减弱ADP抑制并提高稳态ATPase活性；βQ259L突变亦能大幅削弱ADP抑制；Caldalkalibacillus thermarum γ亚基N端正电荷残基突变使ATPase活性升高35倍。相反，α亚基非催化位点附近的αD261N突变和Rhodobacter capsulatus γM23K突变则增强ADP抑制。γM23K的作用被认为是通过与β亚基DELSEED基序的静电相互作用稳定γ亚基在ADP抑制态所对应的角度，从而促进酶失活。
非催化核苷酸结合位点在ADP抑制的调节中扮演重要角色。FOF1的α3β3六聚体含有三个催化位点和三个非催化位点。多个研究表明，非催化位点结合ATP可促进ADP抑制态的酶激活：在叶绿体和线粒体F1中，ATP与第二、第三个非催化位点的缓慢结合与抑制性ADP释放及ATPase活性恢复相关。对Bacillus sp. PS3 α3β3γ复合体的突变研究表明，当非催化位点核苷酸结合能力被完全破坏（ΔNC突变体）时，ADP抑制显著增强，ATPase活性几乎完全丧失，但在高浓度磷酸根存在下仍可恢复至野生型的10%左右，并能在脂质体中驱动质子转运。这提示非催化位点的核苷酸结合在缓解ADP抑制中具有重要作用，但并非磷酸根激活所必需。
去垢剂月桂基二甲基氧化胺（LDAO）是研究ADP抑制的重要工具。LDAO能显著激活细菌、叶绿体和线粒体FOF1的ATPase活性，其激活程度常与ADP抑制强度相关。实验表明，LDAO可加速抑制性MgADP从催化位点的解离，并可能通过提高非催化位点对ATP的亲和力或直接改变催化位点的核苷酸结合特性来行使功能。单分子实验也证实LDAO能缩短Bacillus sp. PS3 α3β3γ复合体在ATP水解过程中因ADP抑制而产生的停顿时长。不过LDAO的确切结合位点和分子机制仍未完全阐明。
关于ADP抑制与ε亚基抑制的关系，文中提出了复杂且尚存争议的图景。细菌和叶绿体FOF1的ε亚基C端结构域可伸入α3β3六聚体内部阻止γ亚基旋转，从而抑制ATPase活性。单分子研究表明，ε亚基抑制态与ADP抑制态对应的γ亚基角度位置相同，且ε亚基可延长ADP抑制态的寿命。但也有研究显示，ε亚基并不影响ADP抑制的发生频率，而主要稳定已形成的抑制态；另有实验提示ε亚基的伸展构象可能直接对抗ADP抑制，甚至在某些条件下刺激ATPase活性。作者提出，体内可能是ADP先抑制酶、阻止γ亚基旋转，随后ε亚基进一步稳定该角度位置并阻碍酶再激活，但这一假说仍需更多实验验证。
文章用图示总结了ADP抑制的循环模型：催化位点可处于空置、结合磷酸根、结合ADP（无磷酸根）、结合ADP和磷酸根、ADP抑制态以及叠氮化物锁定态。PMF通过提高催化位点对磷酸根的亲和力降低ADP单独结合的概率，从而防止酶进入抑制态；同时，PMF驱动的γ亚基旋转可将已处于ADP抑制态的酶重新激活。因此，当膜能化水平下降时，ADP抑制概率增大，活性酶分子减少，膜质子电导下降，有利于维持PMF；当PMF回升至足够高时，抑制性ADP被释放，酶恢复活性。这种机制使活性FOF1分子池能够根据初级质子泵的活性进行精细调节。
与其他物种相比，大肠杆菌FOF1的ADP抑制较弱，且磷酸根不仅不能缓解抑制，反而增强抑制。文章认为这可能与大肠杆菌主要生活在近厌氧环境、其FOF1主要作为ATP驱动的质子泵生成PMF有关：若抑制后的再激活需要高PMF，而PMF主要由FOF1自身产生，则强烈的ADP抑制会导致不可逆失活。这一进化适应解释了大肠杆菌酶与其他需氧或光合细菌酶的差异。
总体而言，ADP抑制是FOF1最保守的ATPase活性调控机制之一。它通过将部分酶分子完全“关闭”来响应膜去能化和细胞内ATP/ADP比值的下降，其激活阈值PMF可能接近或超过ATP合成所需值。该机制不仅保护细胞在缺血、暗期或膜能化不足时免受ATP耗竭，还通过调节活性酶分子数量参与细胞能量代谢的精细平衡。文章最后强调，ADP抑制与ε亚基抑制、非催化位点核苷酸结合、磷酸根效应之间的时空关系仍不明确，未来需结合结构生物学、单分子技术和突变分析进一步阐明其分子细节及生理整合机制。