内质网锚定转录因子bZIP17和bZIP28调控根伸长机制研究

作者与发表信息

本研究由日本理化学研究所可持续资源科学中心的June-Sik Kim、东京大学农学生命科学研究科的Kazuko Yamaguchi-Shinozaki和Kazuo Shinozaki共同完成，于2018年3月发表在《Plant Physiology》期刊（第176卷，2221-2230页）。

研究背景

内质网未折叠蛋白响应（Unfolded Protein Response, UPR）是真核生物中调控内质网稳态的重要转录调控网络。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，三个bZIP转录因子（bZIP17、bZIP28和bZIP60）参与UPR调控。虽然bZIP28和bZIP60的功能已有较多研究，但bZIP17的生理和转录调控作用仍不清楚。本研究通过构建bZIP17和bZIP28的双敲除突变体，揭示了这两个转录因子在植物发育和UPR调控中的关键作用。

研究方法与流程

1. 突变体构建与表型分析

研究团队通过杂交两个T-DNA插入系（bzip17-2和bzip28-2）获得了双敲除突变体（17/28）。由于该组合的分离比严重偏离孟德尔遗传规律，研究者通过数千次尝试才获得少量存活的双突变体。表型分析包括： - 生长表型：测量4周龄植株的莲座半径、发芽频率和主根长度 - 显微观察：使用体视显微镜记录根尖形态和细胞排列 - 互补实验：采用独立的等位基因组合（bzip17-1/bzip28-3）验证表型特异性

2. 分子互作验证

通过双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）技术，在拟南芥叶肉原生质体中验证了bZIP17和bZIP28的相互作用。将两个转录因子的全长编码序列分别克隆到pUC-SPYCE®和pUC-SPYNE®173载体，检测黄色荧光蛋白信号在细胞核内外的分布。

3. 三重突变体尝试

研究者尝试构建bZIP17、bZIP28和bZIP60的三重敲除突变体，但仅获得一个杂合突变体（bzip60-1/17/28+/-）。对该突变体进行了详细的形态学分析，包括植株结构、叶片毛状体和花器官发育的观察。

4. 转录组分析

采用RNA-seq技术对四种双突变体（17/28、17/60、28/60和s1p/2p）进行转录组分析： - 样本处理：12天龄幼苗用三种内质网应激诱导剂（AZC、DTT和TM）处理6小时 - 测序：使用Illumina HiSeq 2500平台进行双端测序（2×101 bp） - 数据分析：采用TopHat2进行序列比对，HTSeq-count获取原始计数，edgeR进行差异表达分析 - 聚类分析：使用cclust包对87个典型UPR基因进行k-means聚类

5. 分子机制验证

通过RT-qPCR验证关键基因的表达变化： - bZIP60激活：检测剪接型和非剪接型转录本 - 下游基因表达：分析SEC31A、BIP等典型UPR基因的表达模式 - 非经典UPR基因：检测EXP8、EXP15等细胞生长相关基因的表达

主要研究结果

1. 双突变体的发育缺陷

17/28双突变体表现出严重的发育异常： - 生长迟缓：莲座半径仅为野生型的60% - 根系缺陷：主根长度仅为野生型的10% - 发芽延迟：发芽率显著低于野生型 这些表型在单突变体中未出现，表明bZIP17和bZIP28功能冗余。

2. bZIP60的过度激活

在17/28突变体中观察到： - bZIP60基础表达水平提高2-3倍 - 非应激条件下已检测到剪接型bZIP60转录本 - 下游基因（如SEC31A）表达上调 表明双突变导致内质网稳态失衡，激活了IRE1-bZIP60通路。

3. 转录组分析发现

RNA-seq分析揭示了三种调控模式： 1. bZIP28主导：调控分子伴侣基因（BIP、CNX等） 2. bZIP60主导：调控分泌途径基因（SAR1A、SEC31A等） 3. bZIP17/28共同调控：177个非经典UPR基因，多数与细胞生长相关

4. 非经典UPR通路

研究发现： - 非经典基因启动子富含CACGT核心 motif - 在应激条件下，bZIP17对维持这些基因表达起主要作用 - 包括EXPANSIN、AUX/IAA等细胞伸长相关基因

研究结论与意义

科学价值

1. 揭示了bZIP17在植物UPR中的关键作用，完善了植物UPR调控网络模型
2. 发现了bZIP17和bZIP28通过非经典UPR通路调控根系发育的新机制
3. 证实了不同bZIP转录因子在UPR中的功能分工和冗余性

应用前景

1. 为作物抗逆育种提供了新的分子靶点
2. 为理解植物内质网稳态与发育的协调机制奠定基础
3. 非经典UPR通路的发现拓展了对植物应激响应的认识

研究亮点

1. 首次成功构建并表征了bZIP17/bZIP28双突变体，解决了该组合可能致死的学术争议
2. 创新性地采用多突变体比较策略，解析了三个bZIP因子的功能冗余与特异性
3. 发现并验证了非经典UPR通路，连接了内质网应激与细胞生长调控
4. 开发了基于RNA-seq的UPR基因分类方法，为后续研究提供了分析框架

其他重要发现

研究还发现： 1. s1p/s2p蛋白酶双突变体的表型弱于17/28突变体，提示存在未知的bZIP加工因子 2. bZIP17/bZIP28可能通过调控生长素信号通路影响根伸长 3. 三重突变尝试表明完全缺失三个bZIP因子可能导致更严重的发育缺陷

这项研究为理解植物如何协调应激响应与生长发育提供了重要见解，未来可进一步探索bZIP17/bZIP28下游的具体效应分子及其在农业中的应用潜力。