CRISPR碱基编辑介导的水稻OsALS1基因人工进化培育新型抗除草剂种质

作者及发表信息
本研究由Yongjie Kuang（中国农业科学院植物保护研究所）、Shaofang Li（中国农业大学）等共同完成，通讯作者为Huanbin Zhou（中国农业科学院植物保护研究所）。论文于2020年4月发表于期刊*Molecular Plant*（Volume 13, Issue 4, Pages 565–572），标题为《Base-editing-mediated artificial evolution of OsALS1 in planta to develop novel herbicide-tolerant rice germplasms》。

学术背景
本研究属于植物基因编辑与作物育种领域，核心目标是通过CRISPR碱基编辑技术（Base Editing）对水稻内源基因OsALS1进行人工进化，创制抗除草剂（Bispyribac-sodium, BS）的新型水稻种质。
背景知识：
1. OsALS1基因功能：编码乙酰乳酸合成酶（Acetolactate Synthase, ALS），是除草剂的主要靶标蛋白。自然突变或人工诱导的ALS功能变异可赋予植物除草剂抗性。
2. 技术瓶颈：传统育种依赖自然变异或随机诱变，效率低且周期长；CRISPR碱基编辑能直接引入单核苷酸变异（SNVs），但针对未知功能SNPs的定向进化仍具挑战性。
3. 科学目标：开发“碱基编辑介导的基因进化”（BEMGE）方法，通过饱和突变OsALS1编码区，快速筛选抗性变异，并验证其农业应用潜力。

研究流程与方法
1. sgRNA文库设计与构建
- 靶标区域：针对OsALS1的1935 bp编码区，设计63条sgRNA，覆盖正反链，按靶区分为6个池（每池10-11条sgRNA）。
- 碱基编辑器：使用胞嘧啶碱基编辑器RBE9（Cas9n-APOBEC1-UGI）和腺嘌呤碱基编辑器RBE14（Cas9n-TadA*），分别实现C>T/G>A和A>G的编辑。

1. 转化与突变诱导

   • 转化方法：采用农杆菌介导法和基因枪轰击法将sgRNA池与碱基编辑器导入水稻（品种Kitaake）愈伤组织。
     
   • 样本量：农杆菌法转化3600个独立愈伤系，基因枪法转化600个系。
     
   • 突变检测：通过高通量测序分析OsALS1靶区的SNVs分布，发现突变热点集中在sgRNA结合区及其侧翼（如P171和R190位点）。
     

2. 抗性筛选与验证

   • 除草剂筛选：在含0.4 mM BS的培养基中筛选存活愈伤组织，获得113株抗性植株（农杆菌法62株，基因枪法51株）。
     
   • 基因型-表型关联：鉴定到6种OsALS1变异，包括P171F、P171L、P171S、R190H等，其中P171F（脯氨酸→苯丙氨酸）抗性最强。
     
   • 遗传稳定性：T1代植株中，P171F纯合体在0.6 mM BS处理下生长正常，且无生长劣势。
     

3. 商业化品种改良

   • 精准编辑：将P171F变异通过RBE9/sgRNA19导入高产水稻品种“南粳46”，编辑效率达10%，且无脱靶效应。
     
   • 田间表现：编辑植株形态与野生型无差异，抗性稳定遗传。
     

主要结果
1. 突变效率与多样性
- 农杆菌法和基因枪法的编辑效率分别为24%和28%，后者更易产生多位点突变。
- 突变类型以C>T/G>A为主（占比70%），但A/T碱基的编辑亦被检测到（图2C）。

1. 抗性机制解析

   • P171位点：对应拟南芥ALS的P197和小麦ALS的P174，其变异（如P171F）通过改变酶结构降低除草剂结合能力。
     
   • 抗性等级：P171F（强抗性）> P171L（中抗性）> P171S/R190H（弱抗性）。
     

2. 技术优势

   • BEMGE方法：通过sgRNA池与多重碱基编辑器的协同作用，实现单基因的饱和突变，覆盖传统方法难以靶向的位点（如P171和R190）。
     

结论与价值
1. 科学意义
- 首次在植物体内实现内源基因的人工定向进化，为作物功能基因组学研究提供新范式。
- 证实碱基编辑可高效创制未知功能SNPs，突破传统育种对已知变异的依赖。

1. 应用潜力
   
   • 抗除草剂水稻种质可直接用于田间杂草治理，减少农药使用。
     
   • BEMGE可推广至其他农艺性状（如株高、产量）的快速改良。
     

研究亮点
1. 方法创新：结合sgRNA池与双碱基编辑器，实现单基因的“全编码区扫描”。
2. 资源创制：OsALS1-P171F是全球首个通过碱基编辑获得的高效抗BS等位基因。
3. 快速育种：从变异筛选到品种改良仅需单代编辑，大幅缩短育种周期。

其他价值
- 研究数据公开于RiceVarMap数据库，为后续ALS抗性机制研究提供参考。
- 技术已申请专利，具备商业化开发前景。

（全文约2000字）