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基于碱基编辑的OsALS1基因人工进化开发新型耐除草剂水稻种质

期刊:molecular plantDOI:10.1016/j.molp.2020.01.010

CRISPR碱基编辑介导的水稻OsALS1基因人工进化培育新型抗除草剂种质

作者及发表信息
本研究由Yongjie Kuang(中国农业科学院植物保护研究所)、Shaofang Li(中国农业大学)等共同完成,通讯作者为Huanbin Zhou(中国农业科学院植物保护研究所)。论文于2020年4月发表于期刊*Molecular Plant*(Volume 13, Issue 4, Pages 565–572),标题为《Base-editing-mediated artificial evolution of OsALS1 in planta to develop novel herbicide-tolerant rice germplasms》。


学术背景
本研究属于植物基因编辑与作物育种领域,核心目标是通过CRISPR碱基编辑技术(Base Editing)对水稻内源基因OsALS1进行人工进化,创制抗除草剂(Bispyribac-sodium, BS)的新型水稻种质。
背景知识
1. OsALS1基因功能:编码乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase, ALS),是除草剂的主要靶标蛋白。自然突变或人工诱导的ALS功能变异可赋予植物除草剂抗性。
2. 技术瓶颈:传统育种依赖自然变异或随机诱变,效率低且周期长;CRISPR碱基编辑能直接引入单核苷酸变异(SNVs),但针对未知功能SNPs的定向进化仍具挑战性。
3. 科学目标:开发“碱基编辑介导的基因进化”(BEMGE)方法,通过饱和突变OsALS1编码区,快速筛选抗性变异,并验证其农业应用潜力。


研究流程与方法
1. sgRNA文库设计与构建
- 靶标区域:针对OsALS1的1935 bp编码区,设计63条sgRNA,覆盖正反链,按靶区分为6个池(每池10-11条sgRNA)。
- 碱基编辑器:使用胞嘧啶碱基编辑器RBE9(Cas9n-APOBEC1-UGI)和腺嘌呤碱基编辑器RBE14(Cas9n-TadA*),分别实现C>T/G>A和A>G的编辑。

  1. 转化与突变诱导

    • 转化方法:采用农杆菌介导法和基因枪轰击法将sgRNA池与碱基编辑器导入水稻(品种Kitaake)愈伤组织。
    • 样本量:农杆菌法转化3600个独立愈伤系,基因枪法转化600个系。
    • 突变检测:通过高通量测序分析OsALS1靶区的SNVs分布,发现突变热点集中在sgRNA结合区及其侧翼(如P171和R190位点)。
  2. 抗性筛选与验证

    • 除草剂筛选:在含0.4 mM BS的培养基中筛选存活愈伤组织,获得113株抗性植株(农杆菌法62株,基因枪法51株)。
    • 基因型-表型关联:鉴定到6种OsALS1变异,包括P171F、P171L、P171S、R190H等,其中P171F(脯氨酸→苯丙氨酸)抗性最强。
    • 遗传稳定性:T1代植株中,P171F纯合体在0.6 mM BS处理下生长正常,且无生长劣势。
  3. 商业化品种改良

    • 精准编辑:将P171F变异通过RBE9/sgRNA19导入高产水稻品种“南粳46”,编辑效率达10%,且无脱靶效应。
    • 田间表现:编辑植株形态与野生型无差异,抗性稳定遗传。

主要结果
1. 突变效率与多样性
- 农杆菌法和基因枪法的编辑效率分别为24%和28%,后者更易产生多位点突变。
- 突变类型以C>T/G>A为主(占比70%),但A/T碱基的编辑亦被检测到(图2C)。

  1. 抗性机制解析

    • P171位点:对应拟南芥ALS的P197和小麦ALS的P174,其变异(如P171F)通过改变酶结构降低除草剂结合能力。
    • 抗性等级:P171F(强抗性)> P171L(中抗性)> P171S/R190H(弱抗性)。
  2. 技术优势

    • BEMGE方法:通过sgRNA池与多重碱基编辑器的协同作用,实现单基因的饱和突变,覆盖传统方法难以靶向的位点(如P171和R190)。

结论与价值
1. 科学意义
- 首次在植物体内实现内源基因的人工定向进化,为作物功能基因组学研究提供新范式。
- 证实碱基编辑可高效创制未知功能SNPs,突破传统育种对已知变异的依赖。

  1. 应用潜力
    • 抗除草剂水稻种质可直接用于田间杂草治理,减少农药使用。
    • BEMGE可推广至其他农艺性状(如株高、产量)的快速改良。

研究亮点
1. 方法创新:结合sgRNA池与双碱基编辑器,实现单基因的“全编码区扫描”。
2. 资源创制:OsALS1-P171F是全球首个通过碱基编辑获得的高效抗BS等位基因。
3. 快速育种:从变异筛选到品种改良仅需单代编辑,大幅缩短育种周期。

其他价值
- 研究数据公开于RiceVarMap数据库,为后续ALS抗性机制研究提供参考。
- 技术已申请专利,具备商业化开发前景。

(全文约2000字)

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