本文档是厦门大学化学化工学院、化学生物学福建省重点实验室、固体表面物理化学国家重点实验室杨朝勇教授团队联合福建医科大学、上海交通大学医学院瑞金医院研究人员，于2024年在《Chemical Science》期刊上发表的题为《Time-resolved single-cell transcriptomic sequencing》的综述文章。该综述系统性地介绍和探讨了时间分辨单细胞转录组测序这一前沿领域的方法学进展与应用。
随着单细胞RNA测序（scRNA-seq, Single-Cell RNA Sequencing）技术的飞速发展，科学家们得以以前所未有的分辨率解析细胞的异质性，绘制复杂的细胞图谱。然而，传统的scRNA-seq技术存在一个根本性局限：它需要裂解细胞以获得其RNA，因此只能提供细胞在某一特定时刻的转录组“快照”。这就像翻阅一本相册，只能看到静止的照片，而无法观看细胞生命活动连续演变的“电影”。在生理和病理条件下，细胞状态是动态变化的。虽然基于scRNA-seq数据的计算算法（如伪时间轨迹分析、RNA速率）被提出来推断细胞动态，但这些方法基于统计学假设，无法真实反映细胞在真实时间尺度上的状态演变轨迹。因此，在scRNA-seq数据中引入实验性的“时间锚点”，以记录基因表达模式的真实时间动态，成为了一个迫切的需求。本综述即围绕“时间分辨单细胞转录组测序”这一核心议题，全面梳理了其技术基础、实现策略和前沿应用。
综述首先回顾了作为时间分析基础的常规scRNA-seq技术，并将其分为两大类：全长scRNA-seq文库构建 和 基于标签的scRNA-seq文库构建。
1. 全长scRNA-seq文库构建：此类方法旨在获取转录本全长序列，能有效检测可变剪接事件、融合基因和转录本异构体。代表性技术包括： * SMART-Seq2：通过模板转换和末端转移酶活性，实现全长cDNA的高覆盖率扩增。 * SMART-Seq3：在SMART-Seq2基础上，于模板转换寡核苷酸中引入唯一分子标识符，实现了等位基因和异构体水平的高精度RNA分子计数。 * VASA-Seq：通过对所有RNA分子进行片段化和加尾，能从单细胞中检测包含非poly(A)尾RNA在内的总转录组，并与微滴微流控兼容，实现了高灵敏度、高通量和低成本的结合。
2. 基于标签的scRNA-seq文库构建：此类方法通常捕获转录本的5‘或3’端短序列，并通过添加细胞条形码和UMI，实现对大量细胞的全局基因表达谱分析。根据条形码引入方式，又可分为： * 液相标签：如STRT-seq、C1 CEL-Seq2和MARS-Seq，通过将含条形码的引物加入反应体系进行标记，灵敏度高但通常通量受限且成本较高。组合索引策略（如sci-RNA-seq）通过多轮“拆分-混合”步骤，利用细胞自身作为分隔室，为每个细胞赋予独特的条形码组合，可实现数十万细胞的超高通量分析，但细胞损失率高，不适用于珍贵样本。 * 固相标签：利用包被有寡核苷酸（含细胞条形码、UMI和oligo dT）的微珠进行RNA捕获。根据细胞与微珠配对方式，主要依赖三种微流控技术： * 微滴微流控：如Drop-seq、inDrops及商业化的10x Genomics Chromium系统，通过油水两相形成纳升微滴共包裹单个细胞与微珠，通量高、成本低，但单细胞包裹率受泊松分布限制。 * 微孔阵列：如Seq-well、Well-Paired-Seq和Microwell-seq，利用重力作用在微型孔洞中隔离细胞与微珠。微孔设计简单，捕获效率（特别是Well-Paired-seq的细胞-微珠配对率>80%）通常高于微滴法，更适合大多数实验室。 * 微阀结构微流控：如Paired-seq、Hydro-seq和DISCO，利用气动阀门精确控制流体，实现细胞与微珠的高效配对，细胞利用率高，特别适合稀有细胞（如循环肿瘤细胞）的分析，但芯片制造和操作较为复杂。
综述的核心部分详细阐述了四种为scRNA-seq文库引入“时间锚点”的实验策略，比较了它们的原理、优缺点和适用场景。
策略一：代谢标记化学 这是最直接的方法，通过向细胞培养体系中加入可被新生RNA掺入的核苷类似物（如4-硫尿苷或5-乙炔基尿苷），然后利用其独特的化学反应性，在测序数据中区分新生RNA与已存在的RNA。 * 原理：例如，4SU可被烷基化试剂转化为胞苷类似物，导致在逆转录和测序时发生T-to-C突变，从而在测序读段中识别出标记RNA。 * 技术整合：该策略已与多种scRNA-seq平台成功整合。 * 与全长/孔板技术整合：如scSLAM-seq和Nasa-seq，将4SU标记与SMART-Seq2结合，适用于数百个细胞的精细分析，但缺乏UMI且成本高。 * 与组合索引技术整合：如sci-fate，将4SU标记与sci-RNA-seq结合，可分析数千细胞，新生RNA检测效率和基因检出能力高，但细胞损失率也高。 * 与微滴微流控整合：如scNT-seq，基于Drop-seq，实现了约6000基因/细胞的高检出，且成本效益大幅提升。 * 与微孔技术整合：如Well-Temp-seq，利用优化的微孔装置，实现了高达80%的细胞-微珠配对率和67.5%的细胞回收率，兼具高效率和高灵敏度。 * 与点击化学及空间成像整合：如scEU-seq利用5-EU的点击化学连接生物素，可物理分离新生与旧RNA；TempO-Map则将5-EU标记与原位测序探针结合，实现了新生RNA的时空同步解析。 * 特点与展望：该策略时间分辨率高（数小时），适合研究细胞对刺激的快速转录响应。未来需开发生物相容性更好的核苷类似物，拓展至组织水平分析，并整合多种标记物以实现多时间点捕获，或结合纳米孔测序研究RNA剪接动态。
策略二：细胞质活检 此策略不裂解细胞，而是利用尖端纳米技术（如流体力显微镜或纳米移液管）从活细胞中顺序提取少量细胞质RNA，从而能够对同一个细胞进行纵向转录组分析，直接关联其历史分子状态与后续表型。 * 原理：如Live-seq利用流体力显微镜精确控制，从活细胞中提取0.1-4 pL细胞质并构建高质量测序文库；后续研究使用耦合电浸润的纳米移液管，进一步实现了自动化操作和活检前引入外源分子的功能。 * 特点与局限：提供了最直接的细胞动态测量，但当前通量极低、成功率有限、基因检测灵敏度不理想，且主要应用于细胞系，对专业设备和技术要求高。
策略三：体内荧光标记 通过在活体动物中，按时间顺序注射不同荧光标记的抗体或利用细胞类型特异性报告基因的时序表达，为细胞打上“时间戳”。随后通过流式细胞术分选带有不同荧光信号的细胞进行scRNA-seq。 * 原理： * Zman-seq：每隔12小时向小鼠血管内注射荧光标记的抗CD45抗体，标记当期血液循环中的免疫细胞。当这些细胞浸润组织（如肿瘤）后，便不再被后续标记。通过分析细胞携带的荧光标记，可推断其进入肿瘤的时间，并结合scRNA-seq绘制免疫细胞在肿瘤微环境中的时间演化轨迹。 * Neurog3Chrono法：在报告小鼠中，利用快速衰减和慢速衰减的两种荧光蛋白，通过其荧光强度比值来推算细胞自特定基因（如Neurog3）表达后所经历的真实时间。 * 特点与局限：适用于在活体环境中追踪细胞群体（特别是免疫细胞）的长期（数天）迁移和状态转变。但面临荧光染料光谱重叠、人体应用效率低以及报告基因构建在人体中的伦理限制等挑战。
策略四：遗传条形码 利用CRISPR-Cas9等技术在细胞基因组特定位点诱导可遗传的突变（“遗传伤疤”），这些突变作为独特的条形码，会在细胞分裂时传递给子代细胞。通过将条形码分析与scRNA-seq结合，可以重建细胞的谱系发育树。 * 原理： * Linnaeus：在斑马鱼胚胎单细胞期注入Cas9/sgRNA，在多个转基因位点产生随机突变。在发育后期，对单个细胞同时进行突变位点靶向测序和scRNA-seq，从而将转录组状态与谱系起源关联起来。 * CARLIN小鼠模型：构建了一个包含10个可诱导CRISPR靶位点的转基因小鼠系，可在特定时间点产生多达44,000种可转录的条形码，用于研究造血系统等过程的克隆动态。 * 特点与展望：能揭示基于转录组相似性无法察觉的、由共同祖先决定的长期发育谱系关系。但面临gRNA设计复杂、潜在脱靶效应等挑战。
综述随后简要总结了该技术在三大领域的应用实例，展示了其强大的科学价值。
1. 免疫反应动态： * Zman-seq 揭示了胶质母细胞瘤中自然杀伤细胞随时间推移功能毒性下降的轨迹，并发现Trem2是关键的调节因子，其拮抗抗体可重编程肿瘤相关巨噬细胞，为免疫治疗提供了新策略。 * Live-seq 通过对同一巨噬细胞在LPS刺激前后的纵向分析，发现NF-κB通路中Nfkbia基因的表达变化是决定细胞反应异质性的关键驱动因素和预测指标。
2. 癌症转录变化： * Well-Temp-seq 分析了结直肠癌细胞在低剂量抗癌药物5-aza-CdR处理下的转录动态，通过关联新旧转录组数据鉴定了关键的协同调控转录因子。 * 细胞质活检 用于追踪胶质母细胞瘤细胞在放化疗前后的亚型转换，发现治疗可能诱导或选择了转录状态更稳定的细胞群体。
3. 胚胎发育轨迹： * TempO-Map 通过脉冲追踪代谢标记与3D原位测序，揭示了干细胞分化过程中，细胞类型标志基因的合成、输出和降解动力学被优先调控。 * 空间转录组技术（如STERO-seq） 通过采集胚胎发育不同时间点的空间全转录组数据，构建了小鼠器官发生的时空图谱。 * Linnaeus 通过遗传条形码重建了斑马鱼幼虫和成体器官的发育谱系树，发现了造血细胞与内皮细胞的共同起源。
综述最后对时间分辨单细胞转录组测序领域进行了总结与展望。四种核心策略各有侧重：代谢标记化学适用于数小时级的快速响应研究；细胞质活检能在数小时至数天尺度上揭示同一细胞的转变；体内荧光标记和遗传条形码则擅长解析数天乃至更长期的细胞群体演化与谱系历史。
尽管该领域已取得显著进展，但未来仍有多个重要发展方向： 1. 多组学整合：将时间分辨转录组与表观基因组、蛋白质组等数据结合，构建更精准的细胞动态模型，阐明不同层次调控事件的时序关系。 2. 时空联合分析：将时间信息与空间转录组信息整合，在细胞所处的原生微环境中理解其动态行为与细胞间通讯。 3. 自动化与商业化：推动相关技术的自动化流程开发和商业化进程，降低使用门槛，使其像常规scRNA-seq和空间转录组技术一样得到广泛应用，从而在基础研究和临床研究中更普遍地用于重建生物过程的动态模型。
本综述由该领域的活跃研究者撰写，具有高度的权威性和时效性。它不仅为初学者系统性地梳理了时间分辨scRNA-seq的技术脉络，也为专业研究人员提供了详尽的方法比较和应用指南。文章清晰地指出，克服scRNA-seq的“静态快照”局限是深入理解生命动态过程的关键，而实验性引入“时间锚点”是实现这一目标的核心突破。通过对现有技术的优缺点剖析和对未来趋势的前瞻，该综述有力地推动了这一前沿交叉领域的发展，为从事细胞异质性、发育生物学、免疫学、肿瘤学等领域研究的科学家提供了重要的方法学参考和灵感来源。