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1. 研究团队与发表信息
本研究由韩国首尔国立大学（Seoul National University）化学系的Daeje Seo、Bonghyun Koh、Ga-Eul Eom、Hye Won Kim及通讯作者Seokhee Kim*共同完成，于2023年4月18日在线发表于《Nucleic Acids Research》期刊（2023年第51卷第10期，文章编号e59），DOI为10.1093/nar/gkad266。
2. 学术背景与研究目标
研究领域为定向进化（directed evolution）与基因特异性体内超突变（gene-specific in vivo hypermutation）。传统定向进化依赖体外基因多样化技术（如易错PCR），而连续定向进化（continuous directed evolution, CDE）通过在细胞内同步实现基因突变、选择和复制，显著提升了进化效率。然而，现有基于脱氨酶（deaminase）与T7 RNA聚合酶（T7 RNA polymerase, T7RNAP）融合的突变系统（如MutaT7）仅能产生C:G→T:A突变，限制了突变谱的多样性。
本研究旨在开发一种新型双突变系统eMutaT7Transition，通过结合两种高效脱氨酶（胞苷脱氨酶PmCDA1和腺苷脱氨酶TadA-8e），实现所有碱基转换突变（transition mutations，包括C:G→T:A和A:T→G:C）的均衡引入，并验证其在蛋白质定向进化中的应用潜力。
3. 研究流程与方法
研究分为以下关键步骤：
（1）突变系统设计与优化
- 构建单脱氨酶突变体：将PmCDA1或TadA-8e分别与T7RNAP融合，形成eMutaT7PmCDA1和eMutaT7TadA-8e。
- 验证TadA-8e效率：通过phes A294G毒性抑制实验（20轮突变循环，每轮4小时生长+稀释），比较TadA-8e与早期版本TadA-7.10的突变频率。结果显示，TadA-8e的突变频率显著更高（平均6.7个突变/1.3 kb基因），且A→G与T→C突变比例均衡（45% vs 55%）。
- 优化辅助因子表达：通过设计优化的核糖体结合位点（RBS）增强尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）的表达，使eMutaT7PmCDA1在野生型菌株中的效率与Δung菌株相当。
（2）双突变系统开发
- 测试三重融合蛋白：尝试将PmCDA1与TadA-8e串联融合至T7RNAP，但发现靠近T7RNAP的脱氨酶占主导（如PmCDA1-TadA-8e-T7RNAP产生84% A:T→G:C突变）。
- 构建双质粒系统：将eMutaT7PmCDA1和eMutaT7TadA-8e表达于同一质粒（pdae079），最终实现两类突变频率无显著差异（50% vs 50%），平均每1.3 kb基因产生5.7个突变。
（3）突变谱与特异性验证
- 高通量测序（Illumina）：分析3.3 kb靶基因区域，确认eMutaT7Transition的突变集中于目标基因（靶区突变频率0.53%，上下游<0.1%），且C:G→T:A与A:T→G:C比例为1:0.93。
- 脱靶效应检测：通过利福平抗性实验证实，系统未显著增加基因组突变。
（4）应用验证：TEM-1 β-内酰胺酶进化
- 抗生素抗性进化：在80小时内，通过逐步增加头孢噻肟（CTX）或头孢他啶（CAZ）浓度，使TEM-1的最低抑菌浓度（MIC）提升至400–1600 μg/mL（CTX）和4000 μg/mL（CAZ）。
- 突变谱分析：鉴定到多种临床相关突变（如I45V、E102K、G236S），涵盖酶稳定性（如M180T）和底物特异性（如E237K）的改善。
4. 主要结果与逻辑关联
- eMutaT7TadA-8e的高效性：其突变频率较TadA-7.10提升多个数量级，为双系统奠定基础（图1）。
- 双系统均衡性：通过质粒构建顺序优化（pdae079），解决了三重融合蛋白的偏向性问题（图3）。
- 广谱突变能力：TEM-1进化中产生的突变覆盖了19%可能的氨基酸变化（单脱氨酶系统仅8.4%），且包含临床分离株常见突变（图6）。
5. 研究结论与价值
- 科学价值：eMutaT7Transition首次实现了体内均衡的碱基转换突变，扩展了定向进化的突变谱，为蛋白质工程提供了更接近自然进化的工具。
- 应用价值：可加速酶、代谢通路或基因电路的优化，尤其在需要复杂突变组合的场景（如抗生素耐药性进化）。
6. 研究亮点
- 双脱氨酶协同：结合PmCDA1与TadA-8e的优势，突破单系统突变谱限制。
- 高效低脱靶：突变频率达∼6.7⁄1.3 kb（80小时），且基因组突变率未显著升高。
- 临床相关性：TEM-1进化中获得的突变与临床耐药株高度吻合，验证了系统的实用性。
7. 其他有价值内容
- 方法普适性：系统成功应用于不同基因（如GFP、MalE）和多基因同步突变（质粒与染色体靶向）。
- 未来方向：需进一步整合颠换突变（transversion）并减少双质粒重组风险。
（注：全文约1500字，涵盖研究全貌及关键细节。）