本文档属于类型a，即一篇关于单一原创研究的学术论文。以下是针对该研究的学术报告：

主要作者及研究机构

本研究的主要作者包括Yucai Li、Shaoya Li、Chenfei Li、Chen Zhang、Lei Yan、Jingying Li、Yubing He、Yan Guo和Lanqin Xia。研究团队来自中国农业科学院作物科学研究所（Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, CAAS）、中国农业大学生物科学学院植物生理与生物化学国家重点实验室（State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Biological Sciences, China Agricultural University），以及海南三亚国家南繁研究院（Hainan Yazhou Bay Seed Laboratory/National Nanfan Research Institute, CAAS）。研究论文于2024年3月21日在线发表在期刊*abiotech*上。

学术背景

本研究的主要科学领域是植物基因组编辑，特别是基于CRISPR/Cas9系统的碱基编辑技术。碱基编辑技术通过在不引起DNA双链断裂的情况下实现单碱基的精准替换，为作物改良和基因功能研究提供了强有力的工具。目前，基于胞嘧啶脱氨酶的CBE（Cytidine Base Editor）和基于腺嘌呤脱氨酶的ABE（Adenine Base Editor）已广泛应用于多种植物中，分别实现了C-to-T和A-to-G的碱基转换。然而，许多重要的农艺性状是由A-to-C或A-to-T的碱基颠换引起的，因此开发能够实现A-to-C/T颠换的碱基编辑器具有重要意义。

本研究的目标是开发一种新型植物碱基编辑器，能够在编辑窗口内同时实现腺嘌呤的转换（A-to-G）和颠换（A-to-C/T）。为此，研究团队分离了水稻内源的N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（OsMPG），并将其与植物腺嘌呤转换编辑器ABE8E融合，开发了两种植物A-to-K（K = G或T）碱基编辑器RAKBE01和RAKBE02。此外，研究团队还通过将OsMPG或其突变体MoSMPG与转录激活因子VP64结合，生成了RAKBE03和RAKBE04，进一步提升了编辑效率。

研究流程

本研究主要包括以下几个步骤：

1. OsMPG的分离与突变体构建
   研究团队首先通过BLAST搜索，从水稻品种“中花11”中分离出OsMPG基因（LOC_Os02g53430）。基于哺乳动物细胞中HMPG突变体能够显著提升腺嘌呤转换效率的报道，研究团队对OsMPG进行了类似突变，生成了突变体MoSMPG（G162R和N168S）。

2. 碱基编辑器的构建
   研究团队将OsMPG或MoSMPG与ABE8E融合，构建了RAKBE01和RAKBE02。此外，为了进一步提升编辑效率，研究团队将转录激活因子VP64与RAKBE01和RAKBE02结合，生成了RAKBE03和RAKBE04。所有碱基编辑器的构建均通过PCR、重叠延伸PCR和一步克隆技术完成，并通过Sanger测序验证。

3. 原生质体实验
   研究团队将构建的碱基编辑器通过PEG介导的转化方法导入水稻原生质体中，并靶向五个内源基因（OsDEP1、OsNRT1.1b、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2和OsWaxy-T3）进行编辑效率测试。编辑结果通过Hi-TOM高通量测序进行分析。

4. 稳定株系实验
   研究团队通过农杆菌介导的转化方法将RAKBE01和RAKBE04导入水稻中，获得了稳定的转基因株系。通过CTAB法提取基因组DNA，并通过PCR和Sanger测序对编辑结果进行基因分型。

5. 数据分析
   编辑效率通过Hi-TOM测序数据计算，编辑窗口和插入/缺失（indels）的频率通过分析测序结果确定。此外，研究团队还通过RT-qPCR分析了靶基因的表达水平，以评估VP64对基因表达的影响。

主要结果

1. 原生质体实验结果
   RAKBE03和RAKBE04在所有五个靶位点均表现出较高的A-to-G转换效率，分别比ABE8E和ABE8E-VP64提升了1.61倍和1.89倍。RAKBE04在A-to-C和A-to-T颠换效率上也有显著提升，分别比RAKBE02提高了1.61倍和4.03倍。此外，RAKBE04的编辑窗口从A3-A6扩展到了A1-A10。

2. 稳定株系实验结果
   在稳定株系中，RAKBE04在所有五个靶位点均实现了A-to-G转换和A-to-T颠换，A-to-G转换效率为70.97%至92.31%，A-to-T颠换效率为1.67%至4.84%。与RAKBE01相比，RAKBE04在A-to-T颠换效率上提升了1.75倍至3.29倍。

3. 插入/缺失（indels）分析
   RAKBE03和RAKBE04在原生质体中诱导了靶向indels，其频率显著低于之前报道的HMPG-based PABEs。在稳定株系中，indels的频率也较低，表明RAKBE04在减少非靶向编辑方面具有优势。

4. VP64对基因表达的影响
   RT-qPCR分析表明，VP64并未显著影响靶基因的表达水平，表明其在提升编辑效率的同时不会对基因表达产生副作用。

结论

本研究成功开发了一种新型植物碱基编辑器RAKBE04，能够在水稻中实现高效的A-to-G转换和A-to-T颠换。RAKBE04不仅扩展了编辑窗口，还显著提升了编辑效率，同时减少了indels的发生。这一研究为作物改良和基因功能研究提供了新的工具，特别是在需要精准碱基替换的场景中具有重要应用价值。

研究亮点

1. 新型碱基编辑器的开发：RAKBE04是首个能够在植物中同时实现A-to-G转换和A-to-T颠换的碱基编辑器。
2. 编辑效率的提升：通过融合VP64，RAKBE04的编辑效率显著提升，且编辑窗口扩展到了A1-A10。
3. 减少非靶向编辑：RAKBE04在减少indels方面表现出色，为精准基因组编辑提供了新的可能性。

其他有价值的内容

本研究还揭示了水稻中碱基切除修复（BER）途径的独特性，为进一步优化植物碱基编辑器提供了理论依据。此外，研究团队还申请了基于本研究结果的专利，表明其具有潜在的应用价值。