研究背景与发表信息

本文报道了一项由法国图尔大学（Université de Tours）植物代谢工程研究团队完成的研究，通讯作者为Pascal Gantet，第一作者为Grégory Montiel。该研究于2006年10月21日在线发表于*Metabolic Engineering*期刊，2007年正式刊出，卷号为9，页码125–132。研究团队所属机构包括图尔大学的“转录因子与植物代谢工程”联合研究单位、植物生物分子与生物技术实验室，以及法国国家农业研究院（INRA）奥尔良森林遗传与生理改良单位。

学术背景与研究目的

植物次生代谢产物在植物生态生理功能中发挥重要作用，且通常在特定器官、组织或细胞类型中合成。长春花（*Catharanthus roseus*）是研究萜类吲哚生物碱（terpenoid indole alkaloids, TIAs）生物合成的模式植物。所有TIAs均来源于由色胺（tryptamine）与环烯醚萜前体开联番木鳖苷（secologanin）缩合形成的异胡豆苷（strictosidine），该反应由异胡豆苷合酶（strictosidine synthase, STR）催化。色胺由色氨酸脱羧酶（tryptophan decarboxylase, TDC）催化色氨酸生成；开联番木鳖苷则从香叶醇（geraniol）经多步酶促反应生成，其中第一步由香叶醇10-羟化酶（geraniol 10-hydroxylase, G10H）催化，最后一步由开联番木鳖苷合酶（secologanin synthase, SLS）催化。香叶醇来源于质体甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径，其中1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXS）催化该途径的第一步反应。单体TIAs如降压药阿吗碱（ajmalicine）主要在根中合成，而长春碱和长春新碱等二聚体TIAs则在叶片中产生。

长春花悬浮培养细胞在生长培养基中不能产生TIAs，但在生长素饥饿或茉莉酸甲酯诱导下可短暂激活相关基因表达。然而，这种诱导是瞬时的，无法实现稳定的次生代谢产物积累。已有研究表明，AP2/ERF结构域转录因子ORCAs可调控部分TIA生物合成基因的表达，但过表达ORCA3不能激活G10H，导致开联番木鳖苷缺乏，无法实现TIAs的持续生产。因此，研究者设想通过表达与根细胞分化相关的转录因子，使未分化的悬浮细胞向根细胞或根组织状态转变，从而恢复单体TIAs的生物合成能力。

本研究选择了拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）的根特异性MADS-box转录因子AGAMOUS-LIKE 12（AGL12）。AGL12基因在根中特异性表达，可能在根器官发生中发挥作用。研究目的是在长春花悬浮细胞中表达AGL12，观察其对细胞形态分化、TIA生物合成基因表达以及阿吗碱积累的影响。

实验流程与研究方法

研究首先验证了长春花中AGL12同源基因的表达模式。通过低严谨度Northern blot杂交，使用拟南芥AGL12 cDNA作为探针，检测了长春花根、叶、花和果实中同源基因的表达。同时检测了多个TIA生物合成酶基因（*STR*、*SGD*、*DXS*、*G10H*、*SLS*、*TDC*）在不同器官中的表达水平，并测定了各器官中阿吗碱的含量。

随后，研究通过基因枪转化法将AGL12表达载体导入长春花C20D悬浮细胞系。C20D是从叶片建立的、依赖2,4-D且不能自主产生生物碱的细胞系。转化采用共转化策略，将携带AGL12 cDNA（由双增强CaMV 35S启动子驱动）的pLBR19质粒与携带潮霉素抗性基因（*hph*）的pGL2质粒按4:1比例混合，用钨粉微粒轰击细胞。对照细胞则用空表达载体与*pGL2*共转化。转化后24小时，细胞转移至含50 mg/L潮霉素的固体培养基上筛选。三周后，挑取抗性愈伤组织并逐步扩增至液体培养基。最终获得四个独立AGL12转基因细胞系（A1–A4）和两个空载体对照细胞系（C1、C2）。通过Southern blot确认了AGL12表达盒在转基因细胞系基因组中的整合，并用Northern blot验证了AGL12转基因的表达。

在细胞形态分析方面，取培养5天的细胞，用FAA固定液固定，石蜡包埋后切成10 μm切片，进行番红-固绿（safranin–astra blue）染色。该染色方法可在无木质素时使多糖呈蓝色，在木质素存在时呈粉红色。切片在明场显微镜下观察并拍照。

在基因表达分析方面，取培养5天的细胞提取总RNA，用Northern blot检测AGL12以及*DXS*、*G10H*、*SLS*、*TDC*、*STR*、*SGD*等基因的mRNA水平。以核糖体蛋白*RPS9*基因作为上样量对照。

在代谢产物分析方面，取培养10天的细胞或植物器官，冻干后取60 mg干重样品，按Mérillon等（1986）的方法提取并定量测定阿吗碱含量。每个样品进行三次独立测量。

主要实验结果

根特异性表达验证显示，AGL12同源基因在长春花根中强烈表达，在叶中弱表达，在花和果实中检测不到。*STR*、*SGD*、*DXS*、*G10H*、*SLS*和*TDC*等基因也主要在根中表达，叶片中表达较弱，其他器官中表达水平更低。阿吗碱主要在根中积累，叶片、花和果实中含量很低。这些结果证实了研究策略的合理性：根特异性转录因子AGL12的表达模式与TIA生物合成酶基因的表达模式以及阿吗碱的积累模式高度相关。

在转基因细胞系的建立方面，Southern blot分析显示，C20D未转化细胞基因组DNA与AGL12 cDNA探针无交叉杂交信号，而四个A系均显示阳性杂交条带。两种限制性内切酶的酶切图谱表明，各A系基因组中整合了多个AGL12表达盒拷贝，且整合位点不同，说明它们来源于独立的转化事件。Northern blot证实A系在预期0.9 kb位置检测到AGL12转基因表达，而C20D和C系即使在低严谨度条件下也无杂交信号。

在细胞形态方面，C20D和C系细胞呈小长条形聚集体，由10–20个细胞组成。而A系细胞（以A4为代表）形成直径可达8 mm的球状体，横切面呈现类似薄壁组织（parenchyma-like）的结构。这表明AGL12足以促进悬浮细胞组织化为球状薄壁样聚集体，但不足以诱导完整的根形态分化。植物器官发生通常需要多个转录因子的协同作用，AGL12可能只是根分化调控网络中的一个组分。

在基因表达和次生代谢产物积累方面，与C20D和C系相比，A系中*SLS*略有下降，*TDC*略有上升，*STR*无影响，*SGD*略有下降，而*DXS*和*G10H*的表达水平显著升高。阿吗碱在C系中检测到低水平，在C20D中低于检测限，而A系的阿吗碱产量显著提高。最佳转基因系A3的阿吗碱含量高于植物各器官中的测定值，约为根中含量的二分之一。值得注意的是，不同A系中*DXS*和*G10H*的mRNA稳态水平与阿吗碱产量并非严格线性相关，提示TIA生物合成途径中可能存在其他限速步骤，或存在转录后调控机制（如酶蛋白稳定性调节）。

结论与意义

本研究证明，拟南芥AGL12转录因子在长春花悬浮细胞中的表达能够促进细胞组织化为球状薄壁样聚集体，并诱导阿吗碱的生物合成。AGL12主要作用于*DXS*和*G10H*的转录水平，这两个基因编码开联番木鳖苷生物合成途径中的关键酶。在未分化的C20D悬浮细胞中，开联番木鳖苷的供给是TIA生物合成的限速前体。通过激活其上游萜类前体合成途径，AGL12解除了这一主要限制，实现了阿吗碱的积累。

本研究的科学价值在于揭示了组织分化相关转录因子与次生代谢途径调控之间的内在联系。*DXS*和*G10H*在叶片中已知在内部韧皮部薄壁细胞中共表达，而AGL12诱导的薄壁样组织结构可能为这些基因的表达创造了合适的细胞环境。这一发现为利用发育调控转录因子作为代谢工程工具开辟了新途径。与直接过表达ORCA3等代谢途径转录因子相比，AGL12通过促进细胞组织结构化而非直接激活终产物合成基因，实现了更完整的途径激活。

应用价值方面，由于许多有价值的植物次生代谢产物在特定细胞类型或组织中合成，通过表达组织分化相关转录因子来调控培养细胞的代谢状态，有望为利用植物细胞培养生产药物活性化合物提供新的工程策略。此外，对根分化调控网络的深入研究可能进一步提高细胞培养中根特异性代谢产物的产量，为工业化生产提供基础。

研究亮点

本研究的创新性主要体现在三个方面。第一，首次证明来自异源植物的根特异性MADS-box转录因子能够在不诱导完整器官分化的情况下，促进悬浮细胞形成薄壁样组织结构并激活根特异性代谢途径。第二，与以往直接调控代谢途径基因的转录因子工程策略不同，本研究采用了“以发育调控驱动代谢调控”的新思路，通过改变细胞的发育状态来重建与分化相关的代谢能力。第三，鉴定出*DXS*和*G10H*为AGL12在长春花细胞中的关键靶标，这为理解发育信号与萜类前体供应之间的分子联系提供了重要线索。