本研究由美国密歇根大学的Claire E. Nason-Tomaszewski、Emily E. Thomas、Daniel L. Matera、Brendon M. Baker和Ariella Shikanov*（通讯作者）合作完成。研究论文《Extracellular matrix-templating fibrous hydrogels promote ovarian tissue remodeling and oocyte growth》发表于期刊*bioactive materials*第32卷（2024年出版），该文已于2023年10月17日在线发表。
本研究的科学领域属于组织工程与再生医学，具体聚焦于生物材料设计及其在女性生育力保护中的应用。背景知识在于，卵巢卵泡（ovarian follicle）是女性生育力和内分泌功能的基础单位。接受化疗等性腺毒性治疗的年轻女性及女童，目前生育力保存的主要有效方法是治疗前冷冻保存卵巢组织。然而，只有最原始的原始卵泡（primordial follicle）和早期初级卵泡能在冷冻过程中存活，但这些卵泡非常不成熟，无法直接用于辅助生殖。因此，开发能够支持这些最不成熟卵泡在体外（in vitro）长期生长、发育至成熟阶段的三维（3D）培养系统，是构建“人工卵巢”（artificial ovary）并实现临床转化的关键挑战。
卵泡在体内的存活和生长依赖于复杂的微环境，这包括卵泡间的旁分泌信号、卵泡与周围基质细胞（stromal cells）的相互作用，以及至关重要的卵泡与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）之间的物理和生化信号交流。现有的三维培养系统（如可降解水凝胶）能够模拟ECM的某些物理特性（如刚度、可降解性），并支持细胞共培养，但通常难以复现体内ECM高度有序的纤维状结构和动态双向重塑（reciprocal remodeling）过程。ECM不仅是静态支架，还能通过整合素（integrin）等受体介导细胞-基质相互作用，调节基质结合的生长因子释放，其纤维状结构被认为对卵泡的生理信号传导至关重要。先前的研究通过在水凝胶中引入ECM隔离肽（ECM-sequestering peptide），如基底膜结合肽（basement membrane binder peptide, BMB），提高了次级卵泡的生长和成熟率，但新沉积的ECM蛋白质结构是无定形的，未能模拟原始卵泡周围高度纤维化和致密的天然ECM结构。因此，如何构建一个既能引导细胞分泌的ECM有序沉积、形成类天然纤维结构，又能支持细胞聚集和ECM动态重塑的培养系统，是本研究旨在解决的核心科学问题。
本研究的目标是：设计并验证一种新型的、由合成纤维强化的水凝胶复合材料，该材料能够作为模板引导细胞分泌的ECM沿纤维有序沉积，从而在体外重建出结构与成分上均类似于天然卵巢基质的纤维状ECM微环境。研究者希望利用此系统培养最原始的卵泡和基质细胞，验证其能否促进卵泡细胞重组为类器官样结构、改善卵母细胞（oocyte）的存活与生长，并阐明细胞-细胞和细胞-基质相互作用在其中扮演的关键角色。
本研究的工作流程结构严谨，主要包含材料制备、表征、卵泡培养与评估、数据分析等多个相互关联的部分。
1. 纤维制备与功能化： 研究首先合成了葡聚糖乙烯基砜（dextran vinyl sulfone, DexVS）聚合物，并通过静电纺丝（electrospinning）技术将其制成微纤维。纤维的平均长度约为67微米，直径约2.1微米，落在卵巢ECM纤维的直径范围内。这些DexVS纤维通过迈克尔加成（Michael-type addition）化学与生物活性肽进行功能化。本研究使用了两种关键肽段：一是经典的整合素结合序列RGD肽，用于介导直接的细胞-材料黏附；二是基底膜结合肽（BMB），其功能是结合细胞分泌的多种ECM蛋白（如层粘连蛋白、胶原蛋白等），从而“隔离”并保留这些内源性ECM。功能化后的纤维被制备成一定体积分数（vol%）的悬浮液备用。
2. 水凝胶复合材料的构建与表征： 水凝胶主体采用八臂聚乙二醇乙烯基砜（8-arm PEG-VS）构建，通过可被纤溶酶（plasmin）降解的多肽交联剂进行交联。研究者设计了不同降解速率的交联肽（快速降解的YKNR，慢速降解的YKNS，以及不可降解的D-YKNS），以调控水凝胶整体的降解动力学。PEG水凝胶本身也可以像纤维一样，被BMB肽功能化（称为“BMB bulk”）。最终的水凝胶复合材料通过将功能化（或未功能化）的DexVS纤维片段与PEG水凝胶前体溶液混合，并封装卵泡和细胞而形成。研究者通过轴向压缩测试和溶胀比测定，确认了嵌入纤维（2% v/v）不会显著改变水凝胶整体的弹性模量（约18-20 kPa）和溶胀性质，从而排除了纤维添加对整体力学性能产生主要影响的可能。
3. 卵泡分离、封装与培养： 研究对象为出生5天的小鼠（B6CBAF1品系）卵巢。通过酶消化法将卵巢解离成包含数百个原始卵泡和基质细胞的混合悬浮液。将此悬浮液与含有或不含纤维的水凝胶前体混合，形成5微升的凝胶液滴并交联。经过条件优化，确定每5微升凝胶封装0.4个卵巢的密度为最佳，可提供足够的旁分泌支持同时避免培养基过快耗尽。封装后的水凝胶在特制的卵泡生长培养基中于37°C、5% CO2条件下进行为期18天的长期培养，每两天更换一半培养基。
4. 实验设计与分组： 为了探究不同细胞-基质相互作用机制和材料参数的影响，研究设置了多组对照实验： - 对照组： 不含纤维的非隔离性水凝胶（Control），或含有未功能化纤维的非隔离性水凝胶（Control fibers）。 - BMB bulk组： PEG水凝胶主体被BMB功能化，但不含纤维。 - BMB纤维组： 非隔离性水凝胶中嵌入BMB功能化的纤维。 - RGD纤维组： 非隔离性水凝胶中嵌入RGD功能化的纤维。 - 纤维密度梯度组： 在非隔离性水凝胶中嵌入不同体积分数（0.5%, 1.0%, 2.0%）的BMB功能化纤维。 - 纤维功能化比例组： 固定总纤维密度为2%，但改变BMB功能化纤维与未功能化纤维的比例（如1:1, 3:1等）。 - 降解性调控组： 使用不同交联肽（100% YKNS， YKNS/YKNR混合， 100% 不可降解D-YKNS）构建的含BMB纤维的水凝胶，以研究水凝胶降解性的影响。 - MMP抑制组： 在YKNS/YKNR交联的含BMB纤维水凝胶培养体系中，加入广谱基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂马立马司他（Marimastat），以抑制细胞对ECM的重塑。
5. 分析与检测方法： 研究采用了多种技术对培养结果进行全面评估： - 卵泡存活、激活与生长评估： 培养2天后，通过免疫荧光染色标记卵母细胞激活标志物Foxo3a的核质转位，量化卵泡激活率。培养18天后，通过酶解法降解水凝胶释放卵泡，统计存活卵母细胞数量并计算存活率（与起始估算卵泡数相比）。同时，测量卵母细胞直径以评估其生长情况。部分卵泡在培养结束后进行体外成熟（in vitro maturation, IVM）培养，评估其发育潜能。 - 细胞聚集与ECM沉积分析： 通过相差显微镜动态观察细胞聚集体的形成。培养结束后，对水凝胶切片进行免疫荧光染色，检测关键ECM蛋白（层粘连蛋白、基底膜蛋白聚糖Perlecan、I型胶原）的沉积情况，并使用共聚焦显微镜成像。通过测量荧光强度并进行归一化处理，定量比较不同条件下ECM的沉积量。 - 激素分泌分析： 收集培养后期的培养基，通过专业的配体分析核心检测卵泡分泌的性激素水平，包括雄烯二酮、雌二醇和孕酮，以评估卵泡的内分泌功能。 - 力学性能监测： 对封装细胞前后以及培养18天后的水凝胶进行压缩测试，量化水凝胶在细胞介导的蛋白水解作用下的软化过程。 - 数据处理： 使用GraphPad Prism 9进行统计分析。多组比较采用Brown-Forsythe and Welch’s ANOVA，随后进行Tukey检验校正。P < 0.05被认为具有统计学显著性。
1. BMB功能化纤维引导ECM沉积与细胞聚集，显著改善卵母细胞结局： 关键发现是，只有在含有BMB功能化纤维的条件下（BMB纤维组），卵泡和基质细胞才表现出强烈的与纤维相互作用的倾向，并聚集形成大型的、类器官样的致密结构。相反，在对照组、仅有BMB bulk（无纤维）组或RGD纤维组，细胞和卵泡保持在小簇状分离状态，或形成铺展的细胞网络而失去了与卵母细胞的连接。免疫荧光定量分析证实，BMB纤维组中层粘连蛋白、基底膜蛋白聚糖和I型胶原的沉积量均显著高于其他对照组。与此相对应，BMB纤维组在培养18天后获得了约14%的卵母细胞存活率，卵母细胞直径增长至约43微米，这两项指标均显著优于对照组（存活率约1-4%，直径约36-38微米）。此外，BMB纤维组还检测到持续升高的类固醇激素分泌，表明卵泡处于健康的生长和分化状态。这些结果首次证明，通过BMB肽将细胞分泌的ECM隔离并“模板化”在合成纤维上，能够重建出富含特定ECM成分的纤维状结构，这一结构不仅能促进细胞聚集（恢复细胞-细胞相互作用），还能通过恢复正确的细胞-基质相互作用来支持卵母细胞生长。
2. ECM隔离作用优于直接的整合素黏附： RGD纤维组虽然能让细胞直接黏附在纤维上，但产生了两种不利结果：大部分凝胶中细胞仅形成小簇，少量凝胶中细胞过度铺展并排挤出卵母细胞。这两种情况下的卵母细胞存活率和生长都极差。这表明，单纯的RGD介导的黏附无法重建卵泡发育所需的微环境。而BMB纤维组通过隔离多种内源性ECM蛋白，为细胞提供了更为复杂和生理相关的配体组合，从而引导了正确的细胞行为和组织重构。对I型胶原沉积的分析显示，在RGD纤维条件下，胶原沉积很少；而在BMB纤维条件下，胶原被大量沉积并整合到聚集体中。这凸显了ECM隔离策略在重建组织特异性细胞-基质对话方面的优势。
3. 纤维密度和BMB比例影响聚集规模而非卵母细胞生长： 随着水凝胶中BMB功能化纤维的体积分数从0.5%增加到2.0%，细胞聚集体的平均横截面积显著增大，卵母细胞存活率也随之提高。然而，在所有纤维密度下，存活下来的卵母细胞最终直径相似（约45微米）。当固定总纤维密度为2%，仅改变BMB纤维的比例时，聚集体的尺寸随BMB比例增加而增大，但卵母细胞的存活率和直径在各组间无显著差异。这表明，即使是少量的BMB功能化纤维也足以启动ECM沉积和细胞聚集，从而恢复支持卵母细胞存活所必需的关键细胞-细胞相互作用；而聚集体的绝对大小可能与更多的细胞被纳入有关，但对于已被“救援”入聚集体的卵母细胞的后续生长影响不大。这提示，初始的、有效的聚集是关键，而非聚集体的最终体积。
4. 水凝胶可降解性与ECM重塑对聚集至关重要： 当水凝胶使用不可降解的交联肽（D-YKNS）时，细胞无法与BMB纤维有效相互作用，几乎不形成聚集体，卵母细胞存活率极低。同样，在可降解水凝胶中加入MMP抑制剂马立马司他，虽然不影响水凝胶主体（由纤溶酶降解），但抑制了细胞对沉积的ECM的重塑，这同样完全阻止了聚集体的形成，并导致卵母细胞存活率骤降。而在可降解的水凝胶（YKNS/YKNR或100% YKNS）中，即使后者降解较慢、形成的聚集体较小，卵母细胞的存活和生长依然表现良好。这些结果强调了两个关键点：第一，细胞需要能够通过蛋白水解作用局部改造其周围的基质（包括水凝胶和自分泌的ECM），以实现迁移、重组和聚集；第二，ECM本身的动态重塑（降解与再沉积）对于维持组织的可扩展性和功能至关重要。不可降解的基质或被抑制的ECM重塑都会使微环境“僵化”，无法支持组织的发育。
本研究成功开发了一种创新的ECM模板化纤维水凝胶复合材料。其核心结论是：利用ECM隔离肽（BMB）功能化的静电纺丝纤维作为支架，可以在可降解的合成水凝胶中引导细胞分泌的ECM有序沉积，形成类天然的纤维状结构。这种仿生微环境通过两个关键机制促进了最原始卵泡的体外发育：（1）促进细胞聚集，恢复了卵母细胞存活所必需的细胞-细胞相互作用；（2）介导生理性的细胞-基质相互作用，支持了卵母细胞的生长和卵泡的内分泌功能。这一效果超越了传统的RGD介导的直接黏附策略。
本研究的科学价值在于：它为解决组织工程中“如何重建复杂ECM结构与功能”这一普遍性难题提供了一个新颖且通用的材料设计策略。该策略将合成材料的可调控性与生物系统的自我组装能力相结合，实现了对ECM结构和组成的双重仿生。在应用价值上，该系统是构建“人工卵巢”的重大进展，为因癌症治疗面临不孕风险的女性及女童的生育力保存提供了极具前景的全新解决方案。此外，该平台还可用于研究早期卵泡发育的机制、筛选必需的基质细胞亚群，并有望推广至更广泛的组织工程和类器官培养领域。
研究还探讨了MMP介导的ECM重塑的关键作用，强调了在静态水凝胶中引入动态双向相互作用的必要性。同时，作者团队在补充材料中提供了详细的实验参数、统计数据和额外的对照结果，增强了研究的可靠性和可重复性。该工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）等机构的资助，并遵循了严格的动物实验伦理规范。