本文是一篇综述论文，题为“Single domain antibody: development and application in biotechnology and biopharma”，发表于 Immunological Reviews 期刊2024年第328卷，页码98至112，DOI为10.1111/imr.13381。该文第一作者为Ting Yu和Fang Zheng（两人贡献相同），通讯作者为Yurong Wen，其所属机构为西安交通大学第一附属医院Med-X研究所及西安交通大学健康科学中心环境与疾病相关基因教育部重点实验室。另一位主要作者Serge Muyldermans来自比利时布鲁塞尔自由大学细胞与分子免疫学实验室。文章于2024年以开放获取形式发表。
本文主题围绕骆驼科动物中天然存在的重链抗体（heavy-chain antibodies, HcAbs）及其可变区来源的单域抗体（single domain antibody, sdAb），又称纳米抗体（nanobody, Nb）或VHH。文章系统回顾了HcAbs的进化起源、遗传与结构适应性特征，以及纳米抗体在生物技术、诊断和临床治疗中的广泛应用，特别聚焦已获批药物和正在进行的医学研究管线。
第一，关于HcAbs的进化起源。 文章指出，HcAbs约在三十年前由R. Hamers团队偶然发现于骆驼科动物中。这类抗体缺乏轻链，仅由两条重链组成，其抗原识别完全依赖单一可变结构域。在骆驼属（*Camelus*）血清中，HcAbs可占总IgG的81%。功能性HcAbs仅存在于骆驼科和软骨鱼中，而在小鼠和人类中出现的类似抗体常与疾病相关。文章从自然选择、适应性互补抗原识别策略以及软骨鱼的趋同进化三个角度探讨了HcAbs的起源。自然选择理论认为，病毒感染（如骆驼痘、流感、SARS、MERS等）和极端环境（如超过40°C的高温、缺水）可能驱动了HcAbs的出现。HcAbs对热具有更高的耐受性，部分VHH可耐受高达90°C的温度，且其重链可变区基因（IGHVH）在野生双峰驼中的表达比例高于家养个体。此外，轻链的缺失降低了轻链沉积病的风险，有利于肾脏功能和水盐保留。在遗传与结构层面，骆驼科IGHVH基因属于IGHV3家族，与常规IGHV基因聚集在同一基因组位点。FR2区的疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代，使VHH失去与轻链可变区（VL）结合的能力。CH1结构域的丢失则由CH1与铰链外显子之间内含子5′端的一个点突变（G>A）引起，该突变在所有骆驼科IGHG基因中保守。这一缺失阻止了BiP伴侣蛋白与重链的结合，使重链无需轻链即可分泌。作为补偿，VHH的CDR1和CDR3环更长，CDR3平均长度为17–18个氨基酸，且CDR1与CDR3之间常形成非经典二硫键以稳定长环结构。铰链区长度多变，从长而灵活到完全缺失不等，影响抗原结合的空间位阻。体细胞高频突变进一步增强了抗原识别多样性。文章还讨论了软骨鱼中的IgNAR，其单可变结构域VNAR与骆驼VHH之间存在趋同进化，尽管两者的基因位点不同，但在可溶性、稳定性及母源传递等方面表现出相似的适应优势。
第二，关于纳米抗体的生产和应用。 文章详细介绍了纳米抗体的发现与生产技术流程。典型流程包括：用目标抗原免疫骆驼科动物（如羊驼、美洲驼或单峰驼）或转基因小鼠；从外周血淋巴细胞提取mRNA并反转录为cDNA；PCR扩增VHH基因片段；将其克隆入噬菌体展示或酵母展示载体构建文库；通过淘选富集抗原特异性克隆；将筛选出的VHH基因亚克隆至表达载体，在大肠杆菌等宿主中表达；最后通过亲和层析纯化并进行表征验证。除免疫文库外，合成文库和天然文库也越来越受欢迎，基于深度测序或质谱鉴定的替代筛选方法也已被开发。纳米抗体在多个领域显示出广泛用途：在肿瘤治疗中可靶向HER2、GPC3、EGFR、PD-L1、VEGF、CTLA-4等标志物；在神经系统疾病中可穿越血脑屏障，靶向Aβ、α-突触核蛋白、LRRK2及趋化因子等；在感染性疾病中可中和流感病毒血凝素、SARS-CoV-2刺突蛋白、HIV的gp120和gp41；也可中和炭疽毒素、肉毒毒素、产肠毒素大肠杆菌毒素及各类动植物和藻类毒素。
第三，关于纳米抗体在诊断中的应用。 文章指出，纳米抗体因其良好的生物分布和高亲和力而日益用于诊断。它们可与多种成像模态偶联：SPECT使用99mTc或111In标记的纳米抗体，可检测HER2阳性肿瘤和动脉粥样硬化斑块，但空间分辨率有限（8–10 mm）；PET使用18F、68Ga、89Zr标记，空间分辨率和灵敏度更高，可实时追踪生物过程，但成本较高；光学成像使用荧光染料，适用于表浅病变和术中成像；超声成像使用微泡偶联纳米抗体，可实时观察血管生成。此外，纳米抗体的稳定性和可溶性使其适用于侧流免疫层析、诊断ELISA和生物传感器等快速检测平台，已被用于检测阿尔茨海默病标志物Aβ和tau、诺如病毒、SARS-CoV-2、MERS、沙门氏菌、大肠杆菌等。
第四，关于纳米抗体作为细胞内探针。 文章从五个方面进行了阐述。在细胞内靶向方法上，可通过转染表达载体产生“chromobodies”，或通过细胞穿透肽修饰实现直接胞质递送。在治疗应用上，自噬靶向纳米抗体嵌合体（ATNCs）可选择性降解不可成药的细胞内蛋白，如靶向HE4抑制卵巢癌细胞增殖和迁移；小分子-纳米抗体偶联诱导邻近分子（SNACIPs）可调控铁死亡和微管成核；靶向BCL11A的细胞穿透型纳米抗体降解剂可诱导胎儿血红蛋白表达，为镰状细胞病和β-地中海贫血提供治疗策略。在递送技术上，激光诱导光穿孔、电穿孔和微流控细胞挤压等方法可实现纳米抗体的高效低毒递送。在成像应用上，荧光标记纳米抗体可用于超分辨显微镜，减少连接误差并提高分辨率。在先进生物传感器方面，NanoB2结合纳米抗体与NanoBRET可实时定量配体-膜蛋白相互作用；V5标签导向纳米抗体可作为细胞内生物传感器监测GPCR信号；intra Q-body探针可低背景可视化活细胞内的p53。
第五，关于纳米抗体的临床成功与技术进展。 文章列举了四种已获批的纳米抗体药物。Cablivi（caplacizumab）由Ablynx开发，于2018年获EMA批准、2019年获FDA批准，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP），通过靶向血管性血友病因子（vWF）抑制其与血小板相互作用。Envafolimab（恩维达）是首个皮下注射的抗PD-L1抗体，于2021年获中国NMPA批准，用于治疗微卫星高度不稳定（MSI-H）和错配修复缺陷（dMMR）的晚期实体瘤。Carvykti（ciltacabtagene autoleucel）是一种CAR-T疗法，于2022年分别获FDA和EMA批准，用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤。Ozoralizumab（Nanozora）由日本大正制药开发，于2022年获日本PMDA批准，是一种双特异性纳米抗体，同时靶向TNF-α和人血清白蛋白以延长循环半衰期。在技术进展方面，多价纳米抗体构建已成为标准程序，针对SARS-CoV-2已成功构建二价、四价、五价甚至十价体，其效力高于单体形式。将纳米抗体嵌入铁蛋白等高稳定性蛋白骨架可提高整体稳定性。计算方法和数据挖掘技术促进了合成或天然VHH文库的构建。纳米抗体的递送方式也扩展至静脉注射、肌肉注射、鼻腔吸入和口服给药等。
第六，论文的意义与价值。 本文系统梳理了骆驼科HcAbs的进化机制及其在生物技术和医学中的转化潜力。文章强调，HcAbs的独特结构——由最小化的单一抗原结合结构域完成抗原识别——为抗体工程和药物开发开辟了新路径。纳米抗体的小尺寸、高稳定性、强抗原结合力、低免疫原性和低成本生产等特性，使其在癌症、神经系统疾病和感染性疾病的靶向治疗中具有显著优势。已上市药物的成功验证了纳米抗体作为治疗药物的可行性，而专利数量的快速增长和学术界与产业界合作的深化则预示着该领域将持续加速发展。文章为免疫学、抗体工程和临床转化研究提供了重要的参考框架。