这是一项由Stefanie L. Baker、Aravinda Munasinghe、Bibifatima Kaupbayeva、Nin Rebecca Kang、Marie Certiat、Hironobu Murata、Krzysztof Matyjaszewski、Ping Lin、Coray M. Colina和Alan J. Russell等人合作完成的原创研究。主要研究机构包括卡内基梅隆大学（Carnegie Mellon University）生物医学工程系、化学系、高分子蛋白质工程中心以及佛罗里达大学（University of Florida）化学系、高分子研究实验室等。该研究于2019年发表在《Nature Communications》期刊上，文章标题为“Transforming protein-polymer conjugate purification by tuning protein solubility”。
这项研究属于蛋白质工程与高分子生物材料交叉领域，核心科学问题是蛋白质-聚合物偶联物（protein-polymer conjugate）的纯化难题。在生物技术产业中，蛋白质纯化成本通常占高价值生物制药制造成本的30%至50%。几乎所有商业蛋白质的纯化都使用硫酸铵沉淀法（ammonium sulfate precipitation）。然而，蛋白质-聚合物偶联物通常从纯化原料开始合成，但要从聚合物、未修饰天然蛋白质以及多种异构体中分离出目标偶联物，一直是该领域长期面临的挑战。该研究旨在通过调控蛋白质表面的聚合物类型、接枝密度和链长，改变蛋白质在盐溶液中的溶解度行为，从而实现偶联物与天然蛋白质的简便高效分离。
研究工作的整体流程包括偶联物合成、表征、硫酸铵沉淀实验、动态光散射分析、原子级分子动力学模拟、酶活性测定以及利用溶解度差异进行纯化验证。研究选用的模式蛋白为溶菌酶（lysozyme，lyz），该蛋白表面有7个可利用的氨基。首先，研究者将带正电的原子转移自由基聚合（ATRP）引发剂共价连接到溶菌酶的氨基上，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）确认平均接枝了5个引发剂（lyz(5+)）。随后，从这些引发剂位点通过ATRP生长出两种不同类型的聚合物：两性离子型聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯（poly(carboxybetaine methacrylate)，pcbma）和中性聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯（poly(oligo(ethylene glycol) methacrylate)，poegma）。每种聚合物分别以目标聚合度（DP）25、50、100、150和200进行合成，实验测得的实际DP对pcbma为18至91，对poegma为25至164。动态光散射（DLS）显示，随着聚合物链长增加，偶联物的水动力学直径从7.9纳米增长到26.2纳米。聚合物通过酸水解从蛋白质上切下后，用凝胶渗透色谱（GPC）分析得到分子量和分散度信息。
在硫酸铵沉淀实验中，天然溶菌酶和引发剂修饰溶菌酶均在约60%硫酸铵饱和度（约2.5 M）时沉淀。然而，lyz(5+)pcbma偶联物在高至100%饱和度（4.1 M）时完全不沉淀，表现出极强的抗盐析能力。相反，lyz(5+)poegma偶联物则表现出随聚合物链长增加而降低的溶解度，短链DP 25约在20%饱和度时沉淀，长链DP 164约在10%饱和度时即沉淀。为了确认这种溶解度变化是由共价连接而非溶液中游离聚合物的存在引起，研究者使用与偶联物中聚合物等质量的游离pcbma和poegma进行对照实验，结果显示游离聚合物不影响天然溶菌酶的沉淀点，证明共价偶联是改变盐溶液溶解度的关键。为了考察接枝密度的影响，研究进一步合成了平均接枝1个和3个引发剂的偶联物，结果发现对于pcbma，只有最低接枝密度且最短链长的lyz(1+)pcbma DP 14发生沉淀；对于poegma，链长比接枝密度对盐析点的影响更显著，长链poegma偶联物不论接枝密度如何均在约20%饱和度沉淀。
动态光散射进一步显示，lyz(5+)pcbma偶联物在硫酸铵浓度从0增加到100%饱和度的过程中，水动力学直径从约8-17纳米逐渐增大到约60纳米，且这种变化是可逆的。在100%饱和硫酸铵中储存2.5个月后，DP 18和DP 91偶联物的尺寸保持稳定。这种尺寸增加可能是由于两性离子聚合物的抗聚电解质效应（anti-polyelectrolyte effect）。为了在分子水平上验证这一机制，研究者进行了原子级分子动力学模拟。模型构建了lyz(5+)pcbma DP 18和lyz(5+)poegma DP 25偶联物，在0到5 M NaCl浓度范围内进行500纳秒和200纳秒的模拟。自由pcbma链的回转半径在不同盐浓度下没有显著变化，而poegma链的回转半径从0 M NaCl时的约20 Å逐步下降到5 M时的16 Å，表明poegma链随盐浓度增加发生坍缩。径向分布函数（RDF）分析显示，对于lyz(5+)pcbma，随着NaCl浓度增加，聚合物侧链氧原子周围出现了额外的溶剂化层（约3.5 Å处出现新峰），氯离子在聚合物附近出现概率增加而钠离子减少，这符合抗聚电解质效应的特征。相反，lyz(5+)poegma的聚乙二醇单元周围的溶剂化层随盐浓度增加而明显减少。这些模拟结果表明，pcbma偶联物通过增强溶剂化层和抗聚电解质效应来阻止盐析沉淀，而poegma偶联物则因聚合物坍缩和去水合而更容易沉淀。
酶活性实验表明，在100%饱和硫酸铵中，lyz-pcbma偶联物仍保持活性，甚至比在低盐磷酸盐缓冲液中的活性最高提高1.6倍。引发剂修饰溶菌酶的活性则提高到4.2倍。这说明硫酸铵的kosmotropic特性有利于蛋白质结构稳定和活性保持。
基于上述溶解度差异，研究者进行了混合物的纯化验证。将天然溶菌酶与lyz(5+)pcbma DP 91以1:99体积比混合，加入硫酸铵至100%饱和度使天然溶菌酶优先沉淀，SDS-PAGE分析显示上清液中天然蛋白条带明显减弱，经过第二轮优先沉淀后检测不到天然溶菌酶。对于天然溶菌酶与lyz(5+)poegma DP 164的混合物，加入硫酸铵至40%饱和度使偶联物优先沉淀，沉淀中未检测到天然溶菌酶，纯化产率约为61%。此外，研究还考察了α-胰凝乳蛋白酶（α-chymotrypsin）偶联物体系，发现两性离子pcbma、正电荷聚合物pqa和pdmaema、负电荷聚合物psma均使偶联物在100%硫酸铵饱和度下仍保持溶解，而中性poegma降低其溶解度至约15%饱和度。
该研究的结论是，通过共价连接不同类型的聚合物，可以显著调控蛋白质在盐溶液中的溶解度。高电荷密度的聚合物（两性离子、正电荷、负电荷）能大幅提高蛋白质溶解度，直至在100%饱和硫酸铵中保持溶解，而中性两亲性聚合物则降低溶解度。这种溶解度差异可直接用于偶联物与天然蛋白质的简便纯化和异质混合物的分级分离。研究还证明，可溶于100%硫酸铵的偶联物在长期储存中保持活性和稳定性。该工作的重要价值在于为蛋白质-聚合物偶联物提供了一种低成本、无需复杂色谱仪器的纯化方法，并展示了通过聚合物设计将蛋白质转化为类似极端嗜盐蛋白的可能性。此外，该研究也为利用硫酸铵作为蛋白质稳定剂和偶联物储存介质提供了新思路。研究亮点在于首次在蛋白质-聚合物偶联物体系中观察到抗聚电解质效应，并将实验结果与原子级分子动力学模拟相结合阐明了分子机制。