细菌还原胺酶（Reductive Aminases）催化可再生肉桂酸衍生物实现伯、仲胺N-烯丙基化的生物催化研究

这篇研究论文由来自Manchester Institute of Biotechnology, University of Manchester和University of Cambridge的研究团队合作完成，主要作者包括Godwin A. Aleku、Gabriel R. Titchiner、George W. Roberts等，通讯作者为Nicholas J. Turner和David Leys教授团队。该研究于2022年5月6日发表于ACS Sustainable Chemistry & Engineering期刊，题为”Enzymatic N-Allylation of Primary and Secondary Amines Using Renewable Cinnamic Acids Enabled by Bacterial Reductive Aminases”。

一、学术背景

烯丙胺（allylic amines）是一类重要的合成砌块，广泛存在于抗真菌药（如特比萘芬）、抗组胺药（如桂利嗪）、钙通道阻滞剂（如氟桂利嗪）和抗抑郁药（如齐美利定）等多种药物分子中。传统过渡金属催化（如Pd、Ir、Rh等）的烯丙基取代反应存在诸多局限性：依赖高活性烯丙基试剂（如碳酸酯、乙酸酯等）、产生化学计量废料、反应条件苛刻等。虽然近年来发展了使用烯丙醇作为绿色烷基化试剂的改进方法，但生物质来源的α,β-不饱和羧酸（如肉桂酸衍生物）作为可再生烷基化试剂的研究尚未系统开展。

在生物催化领域，已有报道利用转氨酶（transaminases）或改造的细胞色素P450（P411）合成烯丙基伯胺的方法，但这些体系无法直接获得仲胺和叔胺类烯丙胺。针对这些挑战，本研究旨在开发一种新型的双酶级联系统：首先利用羧酸还原酶（carboxylic acid reductase, CAR）将可再生肉桂酸还原为α,β-不饱和醛中间体，随后通过细菌来源的还原胺酶（Reductive Aminase, RedAm）催化实现伯胺和仲胺的还原性N-烯丙基化，从而构建结构多样的仲胺和叔胺骨架。

二、研究流程与方法

1. 还原胺酶的筛选与鉴定

研究团队首先对384种宏基因组来源的亚胺还原酶（IREDs）库进行筛选。通过基于裂解液的比色法初筛（以N-肉桂基环丙胺为底物），获得5个活性候选酶（PIR13、PIR23、PIR107、PIR114和PIR120）。随后通过气相色谱（GC）分析正向反应（肉桂醛与环丙胺的还原胺化），确定来自*Cystobacter ferrugineus*的PIR23为最优催化剂（支持信息图S1）。

同时，研究者从巴西圣保罗动物园堆肥宏基因组中鉴定了新型细菌还原胺酶BacRedAm。序列分析表明，尽管BacRedAm与真菌RedAms（如AspRedAm和AdRedAm）仅有约50%序列相似性，但关键活性位点残基（D169、Y177、N93）完全保守（真菌RedAm编号）。在大肠杆菌BL21中可溶性表达这两个酶，产量较高便于纯化。

2. 酶动力学参数测定

通过稳态动力学分析比较PIR23和BacRedAm对不同底物的催化效率： - 对于环己酮与环丙胺模型反应，BacRedAm显示出更高的催化效率（kcat=5.1 s^-1 vs PIR23的3.5 s^-1） - 对于α,β-不饱和醛底物，PIR23对肉桂醛（cinnamaldehyde）的胺化速率（最高kcat=0.77 s^-1）显著优于BacRedAm（活性低一个数量级） - 饱和类似物氢化肉桂醛（hydrocinnamaldehyde）的胺化速率比肉桂醛快3-5倍（PIR23最高kcat=1.84 s^-1）

底物谱研究表明，PIR23可有效催化多种伯胺（如环丙胺、炔丙胺、烯丙胺）和仲胺（如吡咯烷、哌啶）与肉桂醛的还原胺化（表1）。

3. 双酶一锅法系统开发

研究团队构建了两步一锅法级联反应体系： 1. 羧酸还原步骤：采用*Segniliparus rugosus*来源的羧酸还原酶（SrcAR）将肉桂酸衍生物还原为α,β-不饱和醛，需要NADPH和ATP供能 2. 还原胺化步骤：PIR23催化醛与胺的还原胺化，利用葡萄糖脱氢酶（GDH）实现NADPH再生

通过该系统成功实现了15种丙烯酸衍生物与8种胺的交叉偶联（图4）。特别值得注意的是： - 含不同取代基（卤素、羟基、硝基等）的肉桂酸衍生物都表现良好相容性 - 首次实现羧酸直接酶法转化为叔胺（如N-肉桂基吡咯烷，收率最高达94%） - 使用聚合磷酸激酶（PPK2）家族成员Chu kinase实现ATP再生，避免化学计量消耗

4. 制备规模验证

在100 mg规模制备实验中： - 单独PIR23催化肉桂醛与环丙胺反应，获得N-肉桂基环丙胺（3a）分离产率68% - 一锅法CAR-PIR23系统催化肉桂酸与环丙胺反应，使用Chu kinase再生ATP时获得3a分离产率58% - 对甲氧基肉桂酸（5）与环丙胺反应获得对应产物5a分离产率76%（表3）

产物的核磁共振（NMR）分析证实，酶催化反应高度选择性还原C=N双键，完整保留了相邻烯烃结构，避免了双烯丙基化和过度还原等副反应。

三、主要研究结果

1. 发现新型细菌还原胺酶：PIR23被证实是首个能够自给自足催化α,β-不饱和醛与胺类进行还原胺化的细菌RedAm，不同于依赖自发亚胺形成的传统IREDs。通过酶反应与非酶对照实验证明，即使在没有自发亚胺形成的情况下（如肉桂醛+烯丙胺组合），PIR23仍能高效催化胺化反应（表2）。

2. 阐明催化机制差异：结构比较发现（图3），虽然细菌PIR23与真菌RedAms在关键催化残基上存在差异（真菌Y177对应PIR23的W179），但仍能高效催化还原胺化。研究者推测，该酶可能通过动态构象变化和水分子介导实现类似催化功能。

3. 开发可持续合成方法：该研究首次实现：

   • 可再生肉桂酸衍生物直接作为烯丙基化试剂
   • 生物催化合成烯丙基仲胺和叔胺
   • CAR-RedAm双酶级联与ATP/NADPH再生系统整合

4. 底物普适性验证：系统考察了30多种底物组合，包括：

   • 芳香族：对氟(4)、对溴(6)、对甲基(5)、对羟基(7)、邻羟基(8)、对硝基(9)等取代肉桂酸
   • 脂肪族：α-甲基(11)、β-甲基(12)肉桂酸及环状类似物(13)
   • 胺类：环丙胺(a)、炔丙胺(b)、烯丙胺©、苄胺(f)、吡咯烷(g)、哌啶(h)等

四、研究价值与亮点

科学价值

1. 扩展了还原胺化生物催化工具箱：发现细菌RedAms对α,β-不饱和羰基化合物的独特催化能力
2. 阐明不饱和亚胺还原的酶学机制：揭示PIR23克服共轭亚胺稳定性的结构基础
3. 搭建生物质到含氮化合物的转化桥梁：将可再生肉桂酸衍生物转化为高值胺类化合物

应用价值

1. 绿色合成：避免使用有毒金属催化剂和活性烯丙基试剂
2. 步骤经济性：一锅法直接从前体酸合成目标胺，简化工艺
3. 选择性控制：完美规避传统方法中常见的过度烷基化和烯烃过度还原问题

创新亮点

1. 方法学创新：首次报道基于羧酸还原酶-还原胺酶的双酶级联体系
2. 底物创新：系统考察生物质衍生丙烯酸作为绿色烯丙基化试剂的适用性
3. 产品创新：突破性实现酶法制备烯丙基叔胺
4. 机制创新：揭示细菌RedAms不依赖自发亚胺形成的独特催化模式

展望与延伸

研究者指出，未来可将该CAR-RedAm系统与上游生物合成途径（如肉桂酸的de novo生物合成）或CO2固定酶偶联，实现从简单原料到复杂胺类的全生物合成。同时，通过超高通量酶筛选技术（如微流控液滴筛选）开发不对称催化的立体选择性变体，将是重要发展方向。

此项工作不仅为可持续合成烯丙胺提供了新型生物催化策略，更为生物质资源的高值化利用开辟了新途径。通过整合合成生物学与生物催化，这种”绿色制造”理念有望在医药、农业化学品等领域产生深远影响。