作者与发表信息
本研究由曹祥林、崔涵、纪欣宇等学者完成，第一完成单位为河南师范大学水产学院，通讯作者为陈建军。该论文于2025年发表在开放获取期刊 *Aquaculture Nutrition*（ aquaculture营养学）上，文章编号为9406490，共19页。
学术背景
饥饿是 aquatic animals（水生动物）生长过程中不可忽视的环境胁迫因素。在自然活动中，如繁殖、气候变化、季节更替等，鱼类会采取一系列生理、生化及行为策略来调节机体能量稳态，以适应饥饿胁迫。在此过程中，氨基酸组成与平衡能够影响营养效果，调节机体的合成代谢与能量信号通路。其中，branched-chain amino acids（支链氨基酸，BCAAs）——包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸——是鱼类体内的必需氨基酸，在能量调节和生长代谢中发挥重要作用。与其他氨基酸不同，BCAAs的主要代谢场所是骨骼肌而非肝脏。已有研究表明，不同比例的复合BCAAs能有效调控成肌细胞的增殖与分化，并能减轻肌肉萎缩。然而，关于BCAAs在鲤鱼体内的营养需求及其调控骨骼肌生长和发育的分子机制，尤其是涉及内源性microRNA（微小RNA，miRNA）的调控路径，报道仍然较少。因此，本研究旨在验证BCAAs对饥饿后鲤鱼生长恢复的作用，并探索miR-203a与fosb proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit（FOSB原癌基因，AP-1转录因子亚基，FOSB）在该过程中的关键调控功能，为优化水产养殖中BCAAs的应用提供理论基础。
研究流程与实验方法
本研究的实验对象为健康鲤鱼（初始体重58.4±2.0克，体长14.90±0.50厘米），共360尾，随机分为四组，每组三个重复。实验首先进行为期4周的饥饿处理，随后投喂添加不同浓度复合BCAAs（亮氨酸:异亮氨酸:缬氨酸=2:1:1）的饲料（0、16、18、20克/千克）进行为期4周的恢复饲养。实验期间水温维持在23±2°C，每日投喂三次（8:00、12:00、18:00），光照周期为12小时光照/12小时黑暗。实验结束后采集骨骼肌组织样本用于后续分析。
研究的技术路线包括以下主要步骤：第一，通过Masson染色对骨骼肌组织进行形态学分析，并用ImageJ软件量化肌纤维面积。第二，采用免疫组织化学染色检测骨骼肌中FOSB和eukaryotic translation elongation factor 2（真核翻译延伸因子2，eEF2/EF）蛋白的表达水平，并通过平均光密度值进行定量。第三，使用small interfering RNA（小干扰RNA，siRNA）体内转染技术敲低FOSB基因表达——共设计并筛选了si-FOSB-34、si-FOSB-680和si-FOSB-1124三条siRNA序列，每尾注射11微克，分别在24小时和48小时后收集组织样本，通过荧光定量PCR检测干扰效率，最终确定si-FOSB-680具有最佳干扰效果。第四，使用5-aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside（AICAR，AMPK激活剂）和NH125（eukaryotic elongation factor-2 kinase即真核延伸因子2激酶Eef2k抑制剂）进行药理学处理，结合FOSB siRNA共处理，以研究AMPK-Eef2k信号通路中FOSB的调控作用。第五，进行miR-203a antagomir体内注射实验，抑制miR-203a表达后观察骨骼肌蛋白合成、自噬及肌细胞增殖分化相关基因的变化。第六，通过生物信息学软件（miRanda、RNAhybrid和TargetScanFish）预测miR-203a与FOSB 3′UTR的结合位点，并采用dual-luciferase reporter assay（双荧光素酶报告基因实验）在293T细胞中验证靶向关系——将FOSB 3′UTR野生型和突变型序列克隆至pmirGLO载体，与miR-203a mimics共转染后检测荧光素酶活性变化。第七，通过定量RT-PCR检测各实验组中蛋白合成、自噬、肌肉发育、细胞增殖和肌肉萎缩相关基因的mRNA表达水平，以rpl8和U6分别作为mRNA和miRNA的内参基因，采用2^(-ΔΔCT)方法进行相对定量分析。
主要实验结果
在生长性能方面，18克/千克BCAAs组的鱼体平均体重在恢复投喂2周后即显著升高，至第8周时明显超过其他实验组。该组肌肉粗蛋白含量和肌纤维横截面积也显著高于对照组。Masson染色结果显示，饥饿导致肌细胞萎缩和肌束间隙增大，而18克/千克BCAAs补充能有效逆转这种损伤。
在分子水平上，BCAAs处理组中mtor（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）、eif4e（真核翻译起始因子4E）和ef的基因表达显著上调，而ampk（腺苷酸活化蛋白激酶）、eef2k和eif4ebp1（真核翻译起始因子4E结合蛋白1）的表达显著下调。自噬相关基因atg12、atg5、atg16、atg4b和lc3b的表达在BCAAs组中显著降低，而p62表达升高，表明BCAAs能促进蛋白质合成并抑制饥饿诱导的自噬。肌肉发育相关基因myod1、myhc和cyclind1的表达在16和18克/千克BCAAs组中均有不同程度的显著上调。
FOSB干扰实验表明，si-FOSB-680注射后骨骼肌中FOSB蛋白水平显著降低，导致肌细胞萎缩和肌束间隙增大。干扰FOSB后，ef和eif4e表达显著下调，eef2k表达显著上调，而mtor、ampk和eif4ebp1的表达无显著变化。自噬相关基因atg5、atg16、atg4b、psme2、lamp2和foxo3a的表达在FOSB敲低后显著升高，p62表达显著下降。肌肉分化相关基因myod1、myog、myhc、cyclind1、pcna均显著下调，而萎缩相关基因atrogin1和murf1则显著上调。这些结果说明FOSB主要通过AMPK-Eef2k通路而非mTOR通路来调节肌肉蛋白质合成，并参与自噬通量和肌肉蛋白质稳态的维持。
AICAR激活AMPK后，fosb和ef的表达被显著抑制，eef2k表达显著升高，而补充BCAAs能够逆转AICAR的抑制作用。FOSB干扰则消除了BCAAs的这种恢复效应。类似地，用NH125抑制Eef2k后，ef和fosb表达显著升高，eef2k表达显著降低，BCAAs共处理进一步增强这一效应，而FOSB干扰则再次逆转。细胞增殖相关基因cyclind1和pcna在NH125或AICAR处理下表达下降，BCAAs补充可以修复这一负面调控，但FOSB敲低后该修复作用消失。
miR-203a在鲤鱼不同组织中的表达以骨骼肌中最高。补充BCAAs后miR-203a的表达呈浓度依赖性下降，与fosb表达呈相反趋势。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-203a mimic与FOSB 3′UTR野生型共转染后荧光素酶活性显著降低，而突变型组无显著变化，证明miR-203a可直接靶向结合FOSB。体内注射antagomir-203a抑制miR-203a后，fosb和ef的表达显著增加，eef2k表达显著降低；共处理FOSB siRNA则逆转了这些变化。自噬相关基因atg5、atg16、lc3、phlpp1、lamp2和beclin1在antagomir-203a处理后均显著下调，而p62表达上调，这些效应同样被FOSB siRNA逆转。萎缩相关基因atrogin1和murf1在抑制miR-203a后显著降低，但在FOSB敲低后恢复上调。肌肉分化相关基因myod1、myog、myhc、myf4以及增殖标志基因cyclind1和pcna的表达在antagomir-203a处理后均显著升高，FOSB敲低则抵消了这种促进作用。
结论与意义
本研究证实，在饲料中补充BCAAs能够通过下调miR-203a的表达，解除miR-203a对靶基因FOSB的抑制作用，从而促进FOSB的表达。FOSB作为AMPK的下游调控因子，通过AMPK-Eef2k通路促进蛋白质翻译延伸，抑制自噬和蛋白质降解途径，最终促进骨骼肌蛋白质沉积和肌细胞增殖与分化，有效修复饥饿造成的肌肉损伤和萎缩。其中18克/千克复合BCAAs添加量的效果最为显著。这一研究不仅揭示了BCAAs—miR-203a—FOSB调控轴在鲤鱼骨骼肌生长中的核心地位，还首次将miRNA介导的表观遗传调控与氨基酸营养调控联系起来，为精准营养调控水产动物肌肉品质提供了新的理论依据和潜在分子靶标。
研究亮点
本研究的创新之处体现在以下方面：第一，首次阐明复合BCAAs通过调控内源性miR-203a靶向FOSB进而影响鲤鱼骨骼肌生长的完整分子通路；第二，发现了FOSB在鱼类骨骼肌中通过AMPK-Eef2k通路而非传统的mTOR通路发挥蛋白合成调控作用；第三，综合运用了siRNA体内转染、antagomir注射、药物激活/抑制以及双荧光素酶报告系统等多层次干预手段，系统验证了信号通路的上下游关系；第四，确定了鲤鱼饥饿恢复过程中复合BCAAs（2:1:1）的最佳添加浓度为18克/千克饲料，具有直接的应用指导价值。