本研究由Mingqian Feng、Hejiao Bian（共同第一作者）以及Mitchell Ho（通讯作者）等人完成，主要作者来自美国国立癌症研究所（National Cancer Institute）分子生物学实验室、Leidos Biomedical Research, Inc.以及马里兰大学巴尔的摩分校（University of Maryland Baltimore School of Medicine）。该研究于2018年11月7日在线发表于*Antibody Therapeutics*期刊，并于2019年正式刊登在第2卷第1期。
一、学术背景
抗体在现代生物技术和疾病治疗中占有核心地位，尤其是传统免疫球蛋白G（IgG）已被广泛用于多种治疗场景。然而，IgG分子量较大（约150 kDa），其抗原结合部位由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）共同组成，即便是将二者以单链可变区片段（scFv）形式重组，分子量仍达25–30 kDa。近年来，来自鲨鱼的免疫球蛋白新抗原受体可变域（VNAR）和骆驼科重链抗体可变域（VHH）等单域抗体（single-domain antibody）引起了研究者的广泛关注。它们的分子量仅为12–15 kDa，具有更好的组织穿透性、更高的稳定性以及结合隐蔽抗原表位的能力。
鲨鱼属于软骨鱼类，是目前已知最早利用抗体参与适应性免疫的物种。其体内存在IgM、IgW和IgNAR三类抗体，其中IgNAR是由两条相同的重链组成的同源二聚体，其每一个重链末端含有一个独立的抗原结合区。根据非经典半胱氨酸残基的数量和位置，VNAR可被分为I型至IV型。I型VNAR含有额外半胱氨酸并形成特殊二硫键，仅在护士鲨（*Ginglymostoma cirratum*）中被报道。II型则通过CDR3与CDR1之间的二硫键维持结构稳定性，III型与II型类似但CDR1中具有保守色氨酸，IV型则缺乏非经典半胱氨酸。VNAR的CDR3长度可达9–34个氨基酸，具有突出的空间构型，能够深入传统抗体难以触及的蛋白质裂缝或酶活性中心。
然而，此前报道的鲨鱼VNAR噬菌体展示文库多样性通常只有约10⁷–10⁸，难以满足治疗性抗体开发对文库容量（通常需要大于10¹⁰）的要求。因此，本研究旨在开发一种高效的文库构建方法，以从六条未经免疫的成年护士鲨中构建容量达到1.2×10¹⁰的大型VNAR噬菌体展示文库，并通过高通量测序（NGS）系统分析其序列多样性，最终验证该文库在治疗性抗体发现中的可行性。
二、研究流程
本研究的第一个关键步骤是建立一种新的文库构建方法，研究者将其命名为“EASEL”，其全称为基于聚合酶链式反应延伸组装和自连接（PCR-extension assembly and self-ligation）的方法。与传统依赖限制性内切酶消化和连接的建库方法不同，EASEL方法首先从六条成年护士鲨（3条雄性、3条雌性）外周血白细胞中提取总RNA，并逆转录为cDNA。使用特异性正向引物和两种反向引物对VNAR序列进行PCR扩增，反向引物中包含有与噬菌粒载体pComb3X骨架同源的19个核苷酸序列。随后，通过交叉延伸PCR（overlap extension PCR）将VNAR片段与线性化的噬菌粒载体骨架进行组装。最终，对组装后的全长产物进行凝胶纯化，并利用T4 DNA连接酶在16°C下进行分子内自连接，形成环状质粒。将连接产物电转化至TG1感受态细胞中，通过琼脂平板上菌落计数确定文库容量为约1.2×10¹⁰个独立克隆。
第二个步骤是利用NGS对文库进行序列分析。将文库中的VNAR插入片段通过XhoI和MscI限制性内切酶切出并纯化后，连接Illumina接头，在Illumina MiSeq平台上使用2×250 bp双端测序，并采用FLASH软件合并双端读段。合并后序列通过自定义Perl脚本进行方向校正和翻译，剔除含有终止密码子的序列，仅保留以“RV”起始并以保守FR4序列结尾的全长VNAR序列。最终获得约119万条独特的全长VNAR序列用于后续分析，分析内容包括半胱氨酸数目与分布、CDR3长度、氨基酸序列变异性以及VNAR类型分类。VNAR类型的划分以框架区（FR）中第21位和第82位的两个经典半胱氨酸作为关键依据，再根据第28位或第34位等位置是否存在额外半胱氨酸进一步区分I型至IV型。
第三个步骤是利用噬菌体展示和淘选（panning）技术验证文库的实用性。选取多种与肿瘤或病毒感染相关的重要抗原作为筛选靶标，包括磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、人类表皮生长因子受体2（HER2）、程序性细胞死亡蛋白1（PD1）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS）和严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS）的刺突蛋白（spike protein）以及绿脓杆菌外毒素PE38。经过四轮淘选后，通过单克隆噬菌体ELISA鉴定特异性结合物。
第四个步骤是对获得的结合物进行可溶性表达和功能验证。将阳性噬菌粒转化至HB2151大肠杆菌中，以IPTG诱导表达可溶性单域抗体，并利用镍柱（HisTrap）纯化带有His标签的VNAR蛋白。通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱（SEC）分析蛋白纯度和聚集状态，并采用FortéBio Octet RED96系统测定结合动力学参数。
三、主要结果
NGS分析结果显示，约119万条全长VNAR序列中，大约5%的序列因缺少第21位或第82位经典半胱氨酸而无法归入已知四种类型。约24%的序列含有第34位额外半胱氨酸，可归为I型，其中约11%属于经典I型（总共含有6个半胱氨酸）。约70%的序列具有第28位额外半胱氨酸，可归为II型或III型，其中约57%为经典II型（总共含有4个半胱氨酸）。IV型仅占总数的约2%。序列重复性分析表明，85%的独特序列在NGS结果中仅出现一次，说明文库具有极高的多样性。CDR3长度分布分析显示，VNAR的CDR3长度可在0至40个氨基酸之间变化，其中I型VNAR的CDR3平均长度略长于II/III型。半胱氨酸总数在VNAR全序列中可为0至11个，CDR3中可为0至6个。氨基酸变异性分析显示，多样性主要集中在CDR3区域，而CDR1、HV2和HV4区域的变异性较低。
在功能验证方面，针对上述肿瘤和病毒抗原成功分离到了一组特异性VNAR结合物。序列分析表明，大多数结合物属于II型VNAR，部分为I型或未定义类型。其中，针对PE38抗原的II型VNAR（命名为PE38-B6）在大肠杆菌中以可溶性单域抗体形式表达，并通过Octet动力学实验测定其解离常数（KD）为10.1 nM，表明该来自未经免疫鲨鱼天然文库的单域抗体具有较高的单体亲和力。此外，针对MERS刺突蛋白的I型结合物MERS-A8和II型结合物MERS-A7也成功实现可溶性表达，产量分别为3.1 mg和8.7 mg（来自600 mL培养物），并在ELISA中验证了对抗原的特异性结合能力。SEC分析表明PE38-B6蛋白以单体形式存在。
四、结论与意义
本研究成功建立了一种基于PCR延伸组装和自连接的EASEL文库构建方法，并利用该方法从六条未经免疫的成年护士鲨中构建了容量高达1.2×10¹⁰的VNAR噬菌体展示文库。NGS分析证实该文库具有极高的序列多样性，涵盖了所有四种已知VNAR类型以及约30%无法归入传统类型的新型VNAR序列。针对多种肿瘤和病毒相关抗原的淘选实验表明，该文库能够高效获得高亲和力的单域抗体结合物，并且I型和II型VNAR均能在大肠杆菌中实现可溶性功能表达。
本研究的科学价值在于：首次以NGS技术对如此大规模的天然护士鲨VNAR序列进行了系统分析，揭示了CDR3长度和半胱氨酸数目的高变异性是VNAR多样性的重要来源。同时，EASEL方法的建立为大型基因表达文库的构建提供了一种快速、高效且通用性强的技术路线，该方法的建库周期仅为数周，而传统方法通常需要数月。在应用价值方面，该VNAR文库可作为一个通用平台，用于筛选针对肿瘤、病毒感染等多种疾病的治疗性单域抗体。由于鲨鱼与哺乳动物在进化上距离较远，鲨鱼VNAR有望对在传统啮齿类动物中免疫原性较弱的保守性哺乳动物靶标产生高亲和力结合物，从而为药物开发提供新的选择。
五、研究亮点
本研究的最大亮点在于EASEL方法的原创性，该方法突破了传统限制性酶切连接法在文库构建中的效率瓶颈，实现了10¹⁰级别文库的快速构建。其次，研究采用了无偏的NGS数据分析策略，不将序列强行归入已知VNAR亚型，而是从整体上分析半胱氨酸分布和CDR3长度，从而更全面地反映了天然护士鲨VNAR的序列特征。最后，文库未经免疫即可获得KD为10.1 nM的高亲和力结合物，展示了天然VNAR抗体库在治疗性抗体发现中的巨大潜力。