类型a：学术研究报告

1972年1月10日，Douglas Brutlag与Arthur Kornberg在*The Journal of Biological Chemistry*（Vol. 247, No. 1）发表了题为《Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. XXXVI. A Proofreading Function for the 3’→5’ Exonuclease Activity in Deoxyribonucleic Acid Polymerases》的研究论文。这项研究由美国斯坦福大学医学院生物化学系完成，得到了美国国立卫生研究院（NIH）和美国国家科学基金会（NSF）的资助。

学术背景

DNA聚合酶（DNA polymerase）在DNA复制中负责催化脱氧核糖核苷酸的聚合，但其精确性依赖于校对机制。此前研究发现，大肠杆菌（*Escherichia coli*）和T4噬菌体DNA聚合酶具有3’→5’外切酶（exonuclease）活性，但其具体功能尚不明确。本研究旨在验证这一外切酶是否通过移除错配的核苷酸（mispaired nucleotides）发挥“校对”（proofreading）功能，从而提高DNA复制的保真度。

研究流程与实验方法

研究分为多个实验模块，主要采用合成双链多聚核苷酸（synthetic double-stranded polynucleotides）作为底物，结合放射性标记技术分析外切酶活性。

1. 底物设计与标记

   • 使用末端转移酶（terminal transferase）合成3’端标记的多聚核苷酸，如d(T)₂₆₀-[³H]d©₁（即260个脱氧胸苷酸末端连接1个³H标记的脱氧胞苷酸）。
     
   • 通过微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）和脾磷酸二酯酶（spleen phosphodiesterase）降解标记链，验证标记核苷酸的分布是否符合泊松分布（Poisson distribution）。
     

2. 外切酶活性分析

   • 测试大肠杆菌DNA聚合酶大片段（large fragment，含3’→5’外切酶活性）和T4 DNA聚合酶对不同底物的作用：
     
     • 单链DNA：如d(T)₃₀₀。
       
     • 双链DNA：如d(T)₃₀₀:d(A)₄₀₀₀（模板链为多聚脱氧腺苷酸）。
       
     • 错配末端：如d(T)₂₆₀-[³H]d©₁:d(A)₄₀₀₀（末端胞苷酸与模板链腺苷酸不配对）。
       
   • 通过DE-81滤纸吸附法（DE-81 paper adsorption assay）定量检测核苷酸水解速率。
     

3. 聚合酶与外切酶的协同作用

   • 在存在脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）的条件下，观察聚合酶是否优先移除错配末端再延伸链。例如：
     
     • 错配末端（如dC）被快速移除后，聚合酶才以dTTP延伸链。
       
     • 正确配对末端（如dT:dA）在dTTP存在时完全不被水解。
       

4. 其他外切酶的比较

   • 对比大肠杆菌外切酶I（Exonuclease I）和外切酶III（Exonuclease III）的底物特异性：
     
     • 外切酶I偏好单链DNA，对错配末端作用缓慢。
       
     • 外切酶III可快速降解双链DNA中的短错配区域（≤3个核苷酸）。
       

主要结果

1. 3’→5’外切酶的校对功能

   • 错配末端（如dC:dA）的水解速率比正确配对末端（dT:dA）快20倍以上。
     
   • 聚合酶仅在错配核苷酸被完全移除后才会延伸链，且dNTPs的存在能完全抑制正确配对末端的水解。
     

2. 温度与结构依赖性

   • 双链DNA的水解速率在37°C比30°C高10倍，表明外切酶需要局部解链的3’端（“frayed end”）。
     

3. 突变体聚合酶的校对缺陷

   • T4基因43温度敏感突变体（tsL56）的聚合酶在30°C下校对功能与野生型无显著差异，但遗传学研究表明其可能因轻微缺陷导致突变率上升。
     

结论与意义

本研究首次明确DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性通过“两步选择”提高复制保真度：
1. 聚合选择：聚合酶选择匹配的dNTP。
2. 校对选择：外切酶移除错配核苷酸。
这一机制解释了DNA复制的高精确性，并为后续研究DNA修复、突变累积（如癌症相关突变）提供了理论基础。

研究亮点

1. 创新方法：使用合成多聚核苷酸和放射性标记技术精确分析外切酶活性。
   
2. 机制阐明：首次证明外切酶的“实时校对”功能。
   
3. 跨物种保守性：大肠杆菌和T4噬菌体聚合酶具有相同机制，提示其进化重要性。
   

其他价值

研究还发现：
- 焦磷酸解（pyrophosphorolysis）仅作用于正确配对末端，与外切酶水解机制不同。
- 外切酶I和III在DNA代谢中分工协作，分别处理单链悬垂和双链缺口。

这项研究为分子生物学中心法则（Central Dogma）的完善提供了关键证据，并启发了后续关于DNA修复酶（如MutS/MutL）的研究。