本文的主要作者为 Haruka M. Funakoshi、Takumi T. Shito、Kotaro Oka 和 Kohji Hotta，其中 Funakoshi 与 Shito 为共同第一作者，Hotta 为通讯作者。研究机构包括庆应义塾大学科学与技术学院生物科学与情报学系、早稻田大学理工学研究所，以及高雄医学大学医学院。本文于 2021 年 10 月 4 日投稿至 *Frontiers in Cell and Developmental Biology*，同年 11 月 29 日被接收，并于 12 月 17 日在线发表。
海鞘（ascidian）属于尾索动物亚门，是脊索动物中与脊椎动物亲缘关系最近的现存类群之一。由于其胚胎发育具有高度确定的细胞谱系（cell lineage）和镶嵌型发育模式，玻璃海鞘（Ciona intestinalis type A）等物种已被广泛用作研究脊索动物发育机制的模型生物。Ascidiella aspersa 是一种全球性分布的入侵性海鞘，近年来因其对扇贝养殖业的严重危害而受到关注。然而，从科学研究角度看，该物种具有一项突出的优势：其卵和胚胎表现出极高的生物透明度。Shito 等人（2020）的高光谱成像分析显示，A. aspersa 卵的透明度高达 88.0% ± 1.6%，这使得其胚胎在活体成像中几乎“隐形”，为深部组织观察和多维图像采集提供了极大便利。
尽管 *Ciona*、Halocynthia 和 Phallusia 等海鞘的发育表已有详尽描述，但 A. aspersa 迄今缺乏标准化的发育分期表，这严重限制了该物种作为模式生物的应用潜力。因此，本研究旨在以 Ciona 的发育分期标准为参照，对 A. aspersa 从受精卵至孵化幼虫的整个胚胎发生过程进行重新定义和分期，并建立一个基于共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）的三维图像资源库，为系统水平的脊索动物发育与进化研究提供基础数据。
本研究的工作流程可分为以下几个关键步骤。
样本采集与胚胎制备。 成体 A. aspersa 采集自日本女川临海实验中心和函馆水产研究所。卵子和精子从生殖管中分离，卵子外层的卵膜（chorion）使用含 0.05% actinase-E 和 1% 巯基乙酸钠的溶液进行酶解法去除。去膜时间相对 Ciona 更长，需 10–20 分钟。去膜后的卵子和胚胎置于 0.1% 明胶包被的培养皿中，以微孔过滤海水（millipore-filtered seawater，MFSW）在 20°C 恒温条件下培养。
立体显微镜延时成像。 为确定各发育阶段的时间节点，研究者使用配备 Peltier 温控台的 Olympus SZX16 立体显微镜进行延时摄影，每 1 或 3 分钟采集一张图像，全程维持 20°C。
共聚焦激光扫描显微镜图像采集。 从受精卵到孵化幼虫，每隔 10–30 分钟固定一批胚胎。使用 40 倍油浸物镜（数值孔径 0.75）和 Alexa Fluor 546 鬼笔环肽（phalloidin）染色皮层肌动蛋白丝，然后在 CLSM 下采集 z 轴间隔为 1 μm 的序列切片图像，每个胚胎约含 100 张切片，由此重建三维图像。所有三维图像均通过可视化软件进行旋转和切面展示。
数据库构建。 研究团队将全部图像数据整合入“RAMNe”网络数据库（https://www.bpni.bio.keio.ac.jp/ramne/latest/index.html）。该数据库支持交互式查看 z 切片和三维旋转图像，并可同时对比 A. aspersa 与 C. intestinalis type A 的对应发育阶段。
钙瞬变成像验证。 为验证该物种在活体生物成像中的实用性，研究者向去膜卵中注射 gcamp6s mRNA（钙离子荧光传感器），在受精后连续记录钙波动态，观察到两轮钙振荡。
本研究在 20°C 条件下重新定义了 A. aspersa 胚胎发生的 26 个发育阶段（stages 1–26），并将其划分为六个时期：受精卵期（zygote period）、卵裂期（cleavage period）、原肠胚期（gastrula period）、神经胚期（neurula period）、尾芽期（tailbud period）和幼虫期（larva period）。各阶段的时间节点、形态标准、尾/躯干长度比（tail/head ratio）及孵化时间百分比均列入发育表。
在卵裂期，A. aspersa 的卵裂模式与 Ciona 高度保守。第一次卵裂将胚胎分为左右两半（stage 2），第二次分为前后两半（stage 3），第三次分裂面略微倾斜，将动物半球与植物半球分开（stage 4）。16 细胞期（stage 5）和 32 细胞期（stage 6）又各自细分为未压实（uncompacted）和已压实（compacted）两个亚期。此阶段显著的标志是 b5.2 和 b6.3 细胞的不等卵裂，其产生的小细胞位于胚胎后端。值得注意的是，在 Ciona 四细胞期易于识别的中心体吸引体（centrosome-attracting body，CAB）结构在 A. aspersa 中并不易见，这可能反映了物种间皮层肌动蛋白组织方式的差异。
原肠胚期（stages 10–13）始于 112 细胞期的 a7.1 细胞顶端收缩，随后内胚层细胞内陷形成原肠。神经板在 stage 12 呈六排细胞排列，至 stage 13 原肠孔几乎闭合，a-line 神经板开始弯曲，标志着神经胚形成的启动。神经胚期（stages 14–16）中，神经板沿前后轴逐渐卷曲闭合。与 Ciona 同期胚胎的菱形形态不同，A. aspersa 在 stage 14 即呈现椭圆形，这是两个物种间显著的形态差异之一。
尾芽期（stages 17–25）进一步细分为初期尾芽（stages 17–18）、早期尾芽（stages 19–20）、中期尾芽（stages 21–22）和晚期尾芽（stages 23–25）。一个关键差异是：Ciona 在初始尾芽期出现典型的沙漏状上皮弯曲（日语称为“kubire”），而 A. aspersa 在同一阶段没有此结构。定量数据显示，A. aspersa 的尾/躯干长度比在 stage 17 为 0.9，stage 22 为 1.8，stage 26 为 3.0；而 Ciona 相应阶段分别为 1.0、1.9 和 4.2。这说明 A. aspersa 幼虫的尾部相对较短，躯干相对较大。此外，A. aspersa 尾弯曲的最强角度出现在 stage 22，且尾部弯曲的松弛时间比 Ciona 更早，最大弯曲程度也较弱。
幼虫期（stage 26）为孵化幼虫。A. aspersa 幼虫的三个乳突（papillae）排列成等腰三角形，而 Ciona 为等边三角形。A. aspersa 的腹侧乳突位置更靠腹面；两对心房水管原基（atrial siphon primordia）位于躯干背侧，而 Ciona 位于躯干侧方。A. aspersa 幼虫尾部侧方表皮细胞约 30 个，少于 *Ciona*，这可能是导致其尾部较短的结构基础之一。
本研究首次为 Ascidiella aspersa 建立了标准化的 26 期发育表，并提供了完整的三维胚胎图像资源，为将该物种建立为模式生物迈出了关键一步。研究表明，A. aspersa 在卵裂模式、原肠形成时间和神经胚发生节奏上与 Ciona 高度保守，说明两个物种共享一套稳健的发育速度调控机制。然而，尾部长度的相对缩短、尾弯曲时程的提前以及幼虫乳突排列和心房水管位置的差异，提示这些形态特征可能反映了海鞘幼虫形态与生态的适应性分化。较短的尾部可能降低蝌蚪状幼虫的游泳能力，但可能在变态速度和附着效率上具有优势。
在应用层面，A. aspersa 的极高胚胎透明度和外源 mRNA 快速翻译能力使其成为活体生物成像和基因编码传感器研究的理想对象。本研究开发的 RAMNe 数据库可供全球研究者自由访问和下载，为不同组学数据在时空尺度上的整合提供了基础，有助于系统水平地理解脊索动物发育与演化。
本研究的亮点可归纳为：第一，首次建立了 A. aspersa 从受精卵到孵化幼虫的完整标准发育表；第二，基于 CLSM 构建了高分辨率的三维图像资源，并开发了可交互比较 A. aspersa 与 Ciona 的网络数据库；第三，定量描述了尾/躯干长度比和尾弯曲角度等形态计量学参数，揭示了两个近缘物种在尾芽期和幼虫期的形态差异；第四，验证了该物种在钙成像等活体生物成像技术中的应用潜力。
研究团队还注意到，去膜后的 A. aspersa 卵对受精条件的敏感性较高，且其繁殖季节明显集中在冬春季，这些都对该物种的实验操作提出了技术要求。此外，本文生成的 RAMNe 数据库中的图像均为开放获取，遵循 CC BY 许可协议，可供其他研究者用于教学和进一步分析。