本研究由 Victor Tkachev、Stefanie Goodell、Anthony W. Opipari、Ling-Yang Hao、Luigi Franchi、Gary D. Glick、James L.M. Ferrara 以及 Craig A. Byersdorfer 共同完成。作者单位包括美国密歇根大学安娜堡分校的儿科学系、妇产科学系及化学系，Lycera 公司，以及匹兹堡大学医学院的儿科血液与骨髓移植及细胞治疗部。该项研究于2015年6月15日发表在 Journal of Immunology 期刊上（最终发表版本：2015; 194(12): 5789–5800. doi:10.4049/jimmunol.1402180）。
本研究主要聚焦于免疫学与免疫代谢学交叉领域，旨在深入探究共抑制受体程序性死亡蛋白-1（Programmed death-1， PD-1）调控T细胞存活的具体代谢机制。PD-1在维持免疫稳态中扮演关键角色，通过负向调节T细胞功能与存活来防止过度的免疫反应。临床上，PD-1阻断疗法（抗PD-1治疗）已被广泛应用于增强抗肿瘤免疫。然而，在骨髓移植后发生的移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease, GvHD）中，阻断PD-1信号会加剧疾病严重程度。虽然已知PD-1与T细胞代谢相关，但其在异体反应性T细胞中调控代谢的具体机制，以及PD-1阻断如何影响T细胞后续对其他代谢干预的反应性，尚不明确。先前研究已知，GvHD期间T细胞的线粒体呼吸、脂肪酸氧化和活性氧产生增加。基于此，本研究团队假设：PD-1通过调控氧化代谢来影响活性氧水平，进而决定异体反应性T细胞的凋亡敏感性。研究旨在验证此假设，并阐明其分子机制，这对于理解PD-1生物学功能及优化基于PD-1的临床治疗策略具有重要意义。
详细实验流程：
本研究采用了多层次、多模型的综合性实验策略，结合体内外实验，系统分析了PD-1信号对T细胞代谢与存活的影响。
实验对象与模型： 研究主要使用小鼠模型，涉及多种同种异体移植GvHD模型，包括主要组织相容性复合体不匹配（如C57BL/6小鼠T细胞移植给B6D2F1 F1代受体）和次要组织相容性抗原不匹配（如C3H.SW T细胞移植给C57BL/6受体）等。作为对照，使用了同基因移植模型。同时，研究也建立了抗原特异性GvHD模型（OT-I T细胞移植给表达卵清蛋白的CAG-OVA受体）和树突状细胞免疫模型，以区分GvHD特异性反应与急性免疫应答。此外，研究还涉及体外混合淋巴细胞反应，并创新性地使用了人源化异种GvHD模型（将人外周血单个核细胞移植给NOD-SCID IL2Rγnull小鼠），以验证发现是否适用于人类T细胞。所用小鼠总数根据实验设计从每组3-8只不等，所有动物实验均遵循相关机构动物管理指南。人类外周血样本来自健康志愿者，遵循IRB批准的知情同意协议。
实验方法与流程：
第一阶段：表征GvHD中T细胞的PD-1与ROS表型。 在建立上述各类小鼠GvHD或对照移植模型后，于移植后特定时间点（通常是第7天）获取脾脏细胞。通过流式细胞术分析供体来源T细胞（通过CD45.1、TCR-β等标志区分）的PD-1表达水平，并使用荧光探针（CellROX Deep Red检测总细胞ROS，MitoPY1检测线粒体H2O2，DHE检测超氧化物，TMRM检测线粒体膜电位）同步检测其活性氧水平。分析时，将T细胞进一步区分为PD-1高表达（PD-1hi）和低表达（PD-1lo）群体，比较其ROS水平差异。同时，检测了其他T细胞活化标志物（如CD71、CD98、CD69等）以评估PD-1/ROS关联的特异性。
第二阶段：探究PD-1信号对ROS水平的调控。 研究采用两种策略干扰PD-1信号：1) 遗传学方法：使用PD-1基因敲除（PD-1KO）或PD-L1基因敲除（PD-L1KO）小鼠作为供体或受体。将PD-1KO供体T细胞或野生型T细胞移植到PD-L1KO受体中，分析供体T细胞的ROS水平变化。2) 药理学方法：在移植后，给受体小鼠注射抗PD-1或抗PD-L1阻断性抗体（体内阻断），或在体外混合淋巴细胞反应中加入这些抗体。随后，同样通过流式细胞术检测不同处理组T细胞的ROS水平、线粒体H2O2及线粒体膜电位的变化，以明确PD-1信号是否直接调控ROS生成。
第三阶段：揭示PD-1调控ROS的代谢机制。 为探究PD-1如何影响代谢从而改变ROS，研究进行了以下实验：1) 使用Seahorse XF24代谢分析仪，测量经PD-L1抗体阻断或对照处理的异体反应性T细胞的耗氧率和细胞外酸化率，评估其氧化磷酸化和糖酵解能力。2) 使用脂肪酸氧化抑制剂依托莫司（etomoxir）预处理T细胞，观察其能否抵消PD-1阻断所引起的ROS降低效应。3) 通过流式细胞术检测葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达，评估PD-1信号对葡萄糖摄取的调控。
第四阶段：阐明PD-1通过ROS诱导T细胞凋亡。 通过流式细胞术检测PD-1hi和PD-1lo T细胞的凋亡标志（Annexin V染色），分析PD-1表达与凋亡的相关性。接着，在PD-1信号被阻断（遗传或药理学）的条件下，检测T细胞凋亡率的变化。为直接证明ROS是PD-1诱导凋亡的下游介质，研究使用了抗氧化剂进行干预：在体外MLR或体内GvHD模型中，给予抗氧化剂MnTBAP或N-乙酰半胱氨酸，然后检测T细胞凋亡率以及GvHD的临床评分，观察抗氧化处理能否逆转PD-1hi T细胞的高凋亡率。
第五阶段：探究PD-1状态对后续代谢干预疗效的影响。 基于前期发现的PD-1hi T细胞具有高ROS表型，研究假设这类细胞可能对靶向高ROS状态的药物更敏感。为此，他们使用了一种F1F0-ATP合酶调节剂LYC-31138。在GvHD模型中，比较了该药物对野生型T细胞与PD-1KO T细胞，或在野生型受体与PD-L1KO受体中，诱导T细胞凋亡及改善生存率的效果差异，旨在验证PD-1信号的存在是否增强了后续代谢干预的疗效。
数据分析： 所有流式数据和代谢数据均使用FlowJo和GraphPad Prism等软件进行分析。统计数据以平均值±标准误表示，采用非配对或配对Student’s t检验（视情况而定）、多重t检验配合Holm-Sidak校正进行组间比较，生存曲线分析使用Mantel-Cox log-rank检验。P < 0.05被认为具有统计学显著性。
主要结果：
结果一： 在多种小鼠GvHD模型以及人MLR、人源化异种GvHD模型中，成功活化的异体反应性T细胞会同步上调PD-1表达并显著升高细胞总ROS及线粒体H2O2水平，形成稳定的“PD-1hi ROShi”表型。这一表型具有特异性：在同基因移植或急性抗原免疫（如树突状细胞免疫）后期（第7天）的T细胞中并未出现，尽管后者发生了强烈增殖和效应分化。值得注意的是，在抗原免疫早期（第3天）T细胞会短暂上调PD-1并伴随ROS升高，但该表型不持久。这表明，持续的异体抗原刺激和/或GvHD特有的炎症环境是驱动“PD-1hi ROShi”表型维持的关键。
结果二： PD-1信号直接正向调控异体反应性T细胞的ROS水平。无论是通过遗传手段（使用PD-1KO T细胞或将T细胞移植入PD-L1KO受体）还是药理学手段（使用抗PD-1/PD-L1阻断抗体）干扰PD-1信号，均能显著降低PD-1hi T细胞的细胞总ROS和线粒体H2O2水平，但不影响PD-1lo T细胞。这一效应在几乎所有测试的MHC或miHC不匹配模型以及人T细胞中均得到验证（除Balb/c→B6模型外，作者认为这可能与供体小鼠品系特异性有关）。此结果将PD-1表达与高ROS代谢表型从相关性推进到了因果性。
结果三： PD-1通过促进脂肪酸氧化驱动的氧化代谢来增加ROS。代谢通量分析显示，PD-L1阻断降低了异体反应性T细胞的基线耗氧率和线粒体膜电位。更重要的是，当使用脂肪酸氧化抑制剂依托莫司处理后，PD-1阻断所引起的ROS降低效应完全消失，即依托莫司处理组与对照组的ROS水平无差异。这表明PD-1驱动的ROS升高依赖于脂肪酸氧化。同时，PD-1阻断后，T细胞的葡萄糖转运蛋白GLUT1表达上调，且在氧化磷酸化被抑制时糖酵解补偿能力增强，提示PD-1信号可能抑制葡萄糖利用，迫使细胞更依赖脂肪酸氧化供能。
结果四： PD-1通过升高ROS来促进异体反应性T细胞凋亡，从而限制其过度扩增并减轻GvHD。流式分析显示，PD-1hi T细胞的凋亡率显著高于PD-1lo T细胞。阻断PD-1信号后，T细胞凋亡减少，数量增加，这解释了为何PD-1阻断会加剧GvHD。关键证据是，使用抗氧化剂MnTBAP或NAC处理，可以在不改变PD-1表达水平的情况下，特异性地降低PD-1hi T细胞的凋亡率，并减轻GvHD严重程度。这直接证明了ROS是PD-1诱导凋亡的关键下游执行者。
结果五： PD-1信号的存在是T细胞对后续ROS依赖性代谢干预产生敏感性的先决条件。由于PD-1hi T细胞具有高ROS特征，它们对F1F0-ATP合酶调节剂LYC-31138（其作用机制部分依赖于高ROS环境）诱导的凋亡特别敏感。实验表明，LYC-31138能有效诱导野生型PD-1hi T细胞凋亡，并改善野生型GvHD受体小鼠的生存率；然而，在PD-1信号已被废除的PD-1KO T细胞或PD-L1KO受体中，LYC-31138的促凋亡和治疗效果则显著减弱或消失。这一发现具有重要的临床启示。
结论与意义：
本研究得出结论：在异体反应性T细胞中，PD-1通过促进脂肪酸氧化来增强线粒体氧化代谢，导致细胞内活性氧水平升高，进而通过ROS依赖的途径诱导T细胞凋亡。这是PD-1在GvHD中限制T细胞过度活化、维持免疫稳态并控制疾病严重程度的一个关键机制。同时，研究揭示了一个此前未被认识的“代谢印记”现象：阻断PD-1信号不仅会降低T细胞当前的基础ROS水平和凋亡率，还会削弱这些细胞对未来靶向高ROS状态的代谢疗法（如F1F0-ATP合酶调节剂）的敏感性。
本研究的科学价值在于，它从代谢角度深入阐明了PD-1调控T细胞存活的具体分子通路，将免疫检查点信号、细胞代谢重编程、氧化应激和细胞凋亡有机地联系起来，丰富了我们对PD-1生物学功能的理解。其应用价值尤为突出：首先，它为理解抗PD-1癌症免疫疗法可能带来的副作用（如加剧自身免疫或GvHD）提供了代谢层面的解释。其次，它提示临床医生，在接受抗PD-1治疗的患者中，若需联合使用传统的、部分依赖ROS机制发挥作用的免疫抑制剂（如糖皮质激素、甲氨蝶呤等），其疗效可能会打折扣，可能需要考虑换用ROS非依赖性的替代药物。最后，研究也暗示，增强PD-1信号或可利用其促ROS和促凋亡效应，成为治疗T细胞介导的自身免疫性疾病的新思路。
研究亮点：
其他有价值内容： 研究还探讨了PD-1调控ROS的细胞特异性（主要作用于PD-1hi细胞，提示为细胞内在过程），并初步排除了NADPH氧化酶在其中的主要作用。此外，文章通过对比不同品系小鼠的结果，提示PD-1对代谢的调控可能受到遗传背景的影响，这为未来个性化医疗研究提供了线索。