热带假丝酵母高效基因操作策略的开发：实现连续基因敲除与异源GFP基因表达

1. 研究团队与发表信息
本研究由江南大学工业生物技术教育部重点实验室的Lihua Zhang、Xianzhong Chen等团队联合德国Evonik Degussa（中国）有限公司的Markus Pötter共同完成，成果发表于2016年8月的《Applied Microbiology and Biotechnology》期刊。

2. 学术背景
热带假丝酵母（*Candida tropicalis*）是一种二倍体酵母，能以正构烷烃为碳源，在生理学研究和工业应用（如长链α,ω-二羧酸DCA生产）中具有重要价值。然而，其基因操作面临三大挑战：稀有密码子使用、连续基因敲除困难及外源基因表达效率低。本研究旨在开发一种基于URA3营养缺陷型宿主的高效基因操作策略，实现连续基因敲除和异源基因（如绿色荧光蛋白GFP）的功能性表达。

3. 研究流程与方法
3.1 营养缺陷型宿主构建
通过化学诱变剂NTG处理野生型ATCC 20336菌株，结合5-氟乳清酸（5-FOA）筛选和测序验证，获得*ura3*突变体（如XZX菌株）。突变位点分析发现Gly203→Asp的保守突变，推测影响URA3蛋白活性。

3.2 基因敲除盒设计
创新性地设计基因敲除辅助序列（GDA）：
- 核心元件：功能性*URA3*基因两侧连接0.3 kb的同源重复序列（GDA，源自*ura3*基因上下游区域）及靶基因同源臂。
- 工作原理：通过有丝分裂中GDA重复序列的高频同源重组（10⁻⁸）实现*URA3*标记的自我剪切，仅保留单一GDA拷贝，使宿主可重复用于后续基因操作。
- 对比传统方法：传统*hisg-ura3-hisg*策略因片段大、扩增效率低而受限，本研究缩短了敲除盒长度并提高重组效率。

3.3 肉碱乙酰转移酶（CAT）基因的双等位基因敲除
- 第一轮敲除：以CAT基因为靶点，构建包含不同长度GDA片段的敲除盒（如gda143、gda324等），转化XZX菌株后通过PCR验证。结果显示gda324效率最高（5.58×10⁻⁸）。
- 标记回收：利用5-FOA筛选获得*ura3*回复突变体（如02-3菌株）。
- 第二轮敲除：以剩余CAT等位基因为靶点重复操作，最终获得双敲除菌株04（*cat::gda324/cat::gda324*）。

3.4 异源GFP基因表达
将三种GFP变体（野生型wtGFP、CTG密码子优化gfpCTC、白色念珠菌密码子优化yEGFP3）整合至CAT基因座：
- 表达盒设计：GFP基因由内源性*GAPDH*启动子和终止子驱动。
- 结果：仅yEGFP3在热带假丝酵母中高效表达（荧光显微镜和RT-qPCR验证），wtGFP因mRNA降解无表达，gfpCTC表达量极低，表明密码子优化对转录和翻译的协同作用。

4. 主要结果与逻辑关联
- 基因敲除效率：GDA324片段使*URA3*标记切除效率较传统*hisg*提高近10倍（表3）。
- 生理验证：双敲除菌株04丧失以十二烷为碳源的能力，DCA12产量提升至12.9 g/L（图3e），证实CAT在β-氧化途径中的关键作用。
- 异源表达突破：yEGFP3的成功表达为热带假丝酵母的合成生物学工具开发奠定基础。

5. 结论与价值
- 科学价值：开发了首个基于GDA的微型“URA3-blaster”系统，解决了二倍体酵母连续基因操作的难题。
- 应用价值：为热带假丝酵母的代谢工程（如DCA高产）和异源蛋白表达提供了高效工具。
- 跨物种意义：证明白色念珠菌密码子优化的基因可在热带假丝酵母中功能表达，拓展了真菌遗传操作策略的通用性。

6. 研究亮点
- 创新方法：首次利用*ura3*基因自身序列作为GDA，缩短敲除盒长度并提升重组效率。
- 多目标实现：在同一研究中整合基因敲除、标记回收和异源表达三大技术难点。
- 机制探索：通过对比不同GFP变体的表达差异，揭示了密码子优化在转录和翻译层面的双重影响。

7. 其他发现
研究发现Gly203可能是URA3蛋白催化活性的关键位点，为后续酶学研究提供了线索。此外，GDA片段的位置（上游或下游）对重组效率无显著影响，提示其通用性可扩展至其他基因操作体系。