这项研究由Liedewij Laan、John H. Koschwanez和Andrew W. Murray共同完成，主要作者Liedewij Laan当时就职于哈佛大学FAS系统生物学中心，现任教于荷兰代尔夫特理工大学。研究论文于2015年10月1日发表在期刊*eLife*上。

这项研究属于细胞生物学与进化生物学交叉领域，核心关注点是细胞功能模块的进化适应性。细胞通过功能性模块来组织其复杂的生命活动，这些模块中往往包含一些关键组分，一旦被移除会严重损害模块功能。但令人困惑的是，这些在模式生物中至关重要的组分在进化距离较远的物种中往往并不保守，这意味着细胞可能通过不同的蛋白质来执行相同的生物学功能。为了探索这一进化和适应性问题，研究团队选择了一个非常具体且破坏性极强的实验方案：删除酿酒酵母中重要的极性基因*BEM1*，然后让这种严重受损的细胞群体在实验室条件下进化1000代，观察它们如何恢复适应度以及通过哪些突变实现恢复。

实验从构建*BEM1*基因缺失的酵母菌株开始。研究者通过孢子形成的方式获得了*bem1Δ*单倍体细胞。*bem1Δ*孢子在平板上形成菌落的频率仅为6±0.4×10⁻⁵，而野生型孢子的成落频率为0.95。显微观察显示，多数*bem1Δ*细胞在500分钟内无法建立极性，表现为各向同性生长形成巨大细胞，且经常发生裂解。在能够极化的少数细胞中，极化速度虽然快，但整体上极性建立机制已经严重受损。在此基础上，研究者从一个*bem1Δ*菌落以及一个野生型对照菌落出发，各建立了10个平行进化的培养体系，通过连续稀释传代进行1000代实验进化。由于污染，最终保留了9个*bem1Δ*谱系和7个野生型谱系。进化初期*bem1Δ*谱系的生长速率比野生型低约12倍，到实验结束时，*bem1Δ*细胞的生长速率已达到其野生型祖先的90%以上。细胞大小分布也由最初的异常增大和高度异质化逐渐恢复至接近野生型的水平，表明极性机制的部分功能重建。

为了确定哪些突变导致了适应性的恢复，研究者对进化后的谱系进行了全基因组测序。在10个*bem1Δ*进化谱系中，发现三个基因发生了重复性突变：*BEM3*在全部10个谱系中发生突变，*NRP1*在5个谱系中突变，*BEM2*在3个谱系中突变。这些突变在其他的酵母进化实验中均未被报道，说明它们是针对*BEM1*缺失的特异性适应。其中A系谱系共享同一个*BEM3*早期终止突变，而T2和T3谱系分别独立获得了不同的*BEM3*早期终止突变。*NRP1*的5个突变均为独立获得的早期终止突变。*BEM2*的突变包括启动子突变和两个保守位点的氨基酸替换。通过Sanger测序对A1和A2谱系不同时间点的等位基因频率进行分析，研究者确定了这三个基因的突变顺序为：先*BEM3*，随后*NRP1*，最后*BEM2*。

为了验证这一突变顺序是否由上位性效应决定，研究者构建了包含*BEM1*、*BEM2*、*BEM3*和*NRP1*不同基因型组合的酵母菌株。实验表明，*bem1Δ bem2Δ bem3Δ nrp1Δ*四重突变体的孢子成落率和生长速率均与野生型非常接近，说明这三个基因的失活基本上抑制了*BEM1*缺失带来的严重极性缺陷。更重要的是，研究者发现了符号上位性：*BEM2*的缺失在*bem1Δ bem3Δ nrp1Δ*背景下能提高生长速率，但在其他基因型背景下却降低适应度或无效果。这意味着突变必须按照特定的顺序发生才能逐步提高适应度，解释了进化轨迹的可重复性。此外，在*bem2Δ bem3Δ nrp1Δ*背景下，功能性*BEM1*的存在反而会稍微损害细胞的适应度，说明极性模块对*BEM1*的依赖性在进化中发生了根本转变。

研究者进一步利用荧光蛋白Spa2-citrine标记极性位点，通过活细胞成像分析不同突变组合对极性动态的影响。结果显示，*bem1Δ*细胞在胞质分裂后出现第一个极性位点的时间显著延迟，且极性建立常常中途失败，同时还经常出现多个极性位点。*BEM3*缺失加快了出芽速度，但多极性位点问题依然存在。*NRP1*缺失缩短了从胞质分裂到第一极性位点出现的时间，提示该基因可能参与极性启动过程。*BEM2*缺失进一步减少了细胞处于未极化状态的时间。综合这些结果，研究团队提出：多个适应性突变通过增加Cdc42的GTP结合活性来补偿*BEM1*的缺失，而无需重建Bem1作为支架蛋白物理连接Cdc24和Cdc42的功能。由于肌动蛋白依赖的正反馈机制在这种补偿中变得更为关键，而该机制单独作用时容易产生多个竞争性极性位点，因此观察到的多极性位点现象与这一模型一致。

这项研究具有多方面的重要意义。从进化生物学角度看，它提供了一个罕见而清晰的案例，展示了在强烈的定向选择压力下，多个独立的平行进化谱系可以沿着高度可重复的轨迹演化，并且这种可重复性可以由基因间的上位性相互作用来解释。此前关于进化可重复性的研究大多关注单一基因内的多个突变，而这项研究首次在功能模块水平上展示了针对严重功能破坏的可重复进化轨迹。从细胞生物学角度看，研究揭示了极性建立的调控网络具有多层冗余和可调节性，使得细胞在失去关键组分后仍能通过失活其他调控因子来恢复基本功能。*NRP1*此前被认为主要参与RNA结合、核糖体生物发生和应激颗粒形成，而这项研究首次将其与细胞极性建立联系起来。此外，该研究还提出了一种关于功能模块进化更替的机制假说：如果关键组分的功能丧失与群体瓶颈或新环境中的选择优势相耦合，细胞可能通过逐步失活原有模块中的其他组分，并可能招募新蛋白质，最终实现整个功能模块的替换。这一假说为解释某些真核生物谱系中缺乏高度保守通路的现象提供了实验依据。

研究的亮点包括：通过实验进化与全基因组测序相结合的策略，成功追踪了适应性突变的时序性和因果关系；通过系统地重建所有可能的突变组合，直接验证了上位性效应对进化路径的约束作用；并将分子水平的突变与细胞水平的极性动态变化联系起来，建立了从基因型到表型的完整解释链条。研究结果还提示，在实验室中观察到的功能丧失型突变驱动的适应性进化，可能也广泛存在于自然种群中，这与已知的病原菌和自然酵母群体中的基因丢失现象一致。