本文档属于类型c，即方法学类文献（protocol），主要描述了一种结合单分子RNA荧光原位杂交（single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization, smFISH）与免疫荧光（immunofluorescence, IF）的技术流程，用于在果蝇卵室中同时检测RNA和蛋白质的空间分布。以下是其核心内容框架：

技术背景与目标

作者团队（Livia V. Bayer等）在《Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols》（Methods in Molecular Biology, 2015）中提出了一种高分辨率的多分子共定位分析方案。该技术的开发背景源于发育生物学中对基因表达时空调控的研究需求：传统ISH（in situ hybridization）和IF技术虽能分别检测核酸和蛋白质，但难以实现单分子水平的RNA定量与蛋白共定位的同步分析。smFISH通过短荧光探针（如Stellaris™探针）标记特定mRNA，结合IF的抗体标记蛋白，可解析RNA-蛋白质复合体（mRNP）的相互作用机制。

技术流程详解

1. 样本制备与固定

   • 对象：果蝇卵巢（10-20对/实验），重点关注卵室链中的特定mRNA（如gurken、oskar）及其调控蛋白。
     
   • 关键步骤：
     
     • 解剖卵巢后，用含4%多聚甲醛的固定液（oocyte fixation solution）交联组织，保留RNA和蛋白的天然定位。
       
     • 透化处理（Triton™ X-100）以增强探针和抗体的渗透性。
       

2. smFISH探针杂交

   • 探针设计：使用20 nt的Stellaris™探针（每靶标30-80条），3′端标记荧光基团（推荐远红光以减少背景）。探针通过在线工具（Biosearch Technologies）自动设计，需优化浓度（起始1 ng/μL）、温度及甲酰胺浓度。
     
   • 杂交条件：37℃避光过夜，探针与靶RNA结合形成高信噪比的荧光斑点。
     

3. 免疫荧光共标记

   • 抗体孵育：一抗（如抗Gurken蛋白抗体）在4℃过夜结合，二抗（荧光标记）室温孵育2-4小时。
     
   • 同步检测：通过调整洗涤缓冲液（含0.05-0.5% Triton™ X-100和BSA）降低非特异性结合。
     

4. 成像与数据分析

   • 显微镜配置：推荐共聚焦显微镜（如Leica DM4000），配合多通道激光（491/561/640 nm）和EMCCD相机。
     
   • 图像处理：使用ImageJ拼接多视野图像，Z轴层扫（0.2-0.5 μm步长）以重建三维分布。
     

技术优势与创新点

1. 高灵敏度与分辨率：smFISH可检测单拷贝mRNA，IF提供蛋白亚细胞定位，两者结合实现mRNP复合体的纳米级解析（图2展示gurken mRNA与蛋白共定位）。
   
2. 流程高效性：传统FISH/IF需5天，而此方案缩短至2天，且兼容多靶标同步检测（如同时标记oskar mRNA和肌动蛋白）。
   
3. 适应性广：适用于多种果蝇发育阶段（从生殖腺到第10期卵室），并可拓展至其他模式生物。
   

应用价值

• 发育生物学：揭示mRNA转运（如oskar向后极定位）与轴形成（bicoid/gurken梯度）的分子机制。
  
• 方法学贡献：为RNA-蛋白质互作研究提供标准化方案，尤其适用于低丰度靶标的可视化。
  

注意事项

• RNase污染控制：全程使用DEPC水处理试剂，避免RNA降解。
  
• 探针优化：需通过实验调整探针数量（48条/靶标为佳）和杂交条件以平衡信号强度与背景。
  
• 抗体兼容性：建议先完成IF再smFISH，避免固定步骤破坏抗体表位。
  

全文通过详尽的实验步骤和注释（如探针设计、缓冲液配方）体现了其可重复性，附带的图示（图1展示oskar/gurken mRNA动态）进一步验证了技术的可靠性。此方案为发育生物学和细胞生物学研究提供了重要的工具支持。