本研究由Hikari Izumi（北海道大学）、Koichiro Gen（西海区水产研究所）、P. Mark Lokman（奥塔哥大学）、Seishi Hagihara、Moemi Horiuchi、Toshiomi Tanaka（静冈县水产研究所）、Shigeho Ijiri（通讯作者）和Shinji Adachi（均为北海道大学）合作完成，成果发表于2019年9月的《Molecular Reproduction and Development》期刊（卷86期12，页码1846-1864）。研究聚焦于脊椎动物发育的母体调控机制，以日本鳗鲡（Anguilla japonica）为模型，通过大规模定量分析鉴定与卵子质量相关的母源转录本（maternal transcripts）。

学术背景

在脊椎动物早期胚胎发育中，母源转录本在受精前积累于卵子中，通过母源-合子转换（Maternal-Zygotic Transition, MZT）调控合子基因组激活（Zygotic Genome Activation, ZGA）前的发育进程。尽管斑马鱼等模式生物中已发现部分母源效应基因，但其分子机制仍不完善。日本鳗鲡作为重要水产养殖物种，人工诱导成熟卵的质量差异显著（优质卵孵化率>80%，劣质卵≤20%），其胚胎表型与斑马鱼母源突变体相似，为研究母源转录本功能提供了独特模型。本研究旨在通过RNA测序（RNA-seq）和定量PCR（qPCR）筛选与发育能力相关的候选母源转录本。

研究流程

1. 样本制备与分组

   • 对象：13尾人工催熟的雌性日本鳗鲡，采集卵子后根据受精率（>80%）和孵化率（优质组>80%，劣质组≤20%）分为两组（优质卵n=6，劣质卵n=7）。
     
   • RNA提取：使用ISOGEN试剂和NucleoSpin RNA II Kit提取总RNA，通过RiboMinus系统去除核糖体RNA（rRNA），保留率%。
     

2. 高通量测序与数据分析

   • 文库构建与测序：采用Illumina HiSeq 2000进行双端测序，平均每样本获得60 million reads（总数据量35.53 GB）。
     
   • 两种组装策略：
     
     • 从头组装（de novo）：使用CLC Genomics Workbench生成619,029条contigs（N50=296 bp），计算RPKM（Reads Per Kilobase Million）值。
       
     • 参考基因组比对：基于日本鳗鲡草案基因组（Henkel et al., 2012），通过TopHat和Cufflinks流程获得85,906条转录本，计算FPKM（Fragments Per Kilobase Million）值。
       
   • 差异表达筛选：
     
     • 分析1（de novo）：筛选RPKM值在劣质卵中显著下调（≥2倍，p<0.05）或完全缺失的contigs，共鉴定1,594条候选序列，其中245条通过BLASTx注释。
       
     • 分析2（参考基因组）：筛选FPKM=0（劣质卵）且FPKM>1（优质卵）的转录本，最终获得150条候选序列（85条可注释）。
       

3. qPCR验证与统计分析

   • 小规模验证（n=3）：从分析1中选取152条contigs设计引物，26条在劣质卵中表达显著降低（p<0.05）。
     
   • 大规模验证（n=6）：结合分析1（36基因）和分析2（72基因），最终确认6个基因（DNAJB4、GNPAT、CARD14、PDP1、FCGBP、TTN）在劣质卵中表达显著下调（p<0.01）。
     
   • 回归分析：通过逐步多元回归发现5个基因（GNPAT、B4GALNT1、ACSL6、RTKN、TRIM24）与孵化率显著正相关（R²=0.811-0.921，p<0.001）。
     

主要结果

1. 差异表达基因：

   • DNAJB4（热休克蛋白家族成员）和FCGBP（IgG结合蛋白）可能通过调节细胞骨架和上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）影响原肠胚形成（gastrulation）。
     
   • CARD14（半胱天冬酶募集域蛋白）通过激活NF-κB信号通路调控中胚层发育。
     
   • PDP1（丙酮酸脱氢酶磷酸酶）参与能量代谢，其不足可能导致原肠胚运动障碍。
     

2. 孵化率相关基因：

   • GNPAT（甘油磷酸酰基转移酶）和B4GALNT1（糖鞘脂合成酶）与神经发育相关，其低表达可能导致胚胎组织缺陷。
     
   • ACSL6（长链脂肪酸连接酶）和RTKN（Rho效应蛋白）分别调控背腹模式形成和细胞迁移。
     
   • TRIM24（转录中介因子）在斑马鱼中参与ZGA启动，其表达量与孵化率高度相关。
     

结论与价值

本研究首次在日本鳗鲡中系统鉴定了10个与发育能力相关的母源转录本（DNAJB4、GNPAT等），揭示了其在原肠胚形成、能量代谢和合子基因组激活中的潜在作用。科学价值在于填补了脊椎动物母源调控网络的空白，尤其是非模式物种的分子机制；应用价值在于为水产养殖中卵质评估提供了分子标记（如GNPAT和TRIM24），可优化人工育苗技术。

研究亮点

1. 方法创新：结合de novo和参考基因组双策略，提高了低丰度转录本的检出率。
   
2. 模型特殊性：利用日本鳗鲡卵质自然变异的特性，模拟了母源突变体的表型。
   
3. 多层级验证：从RNA-seq筛选到qPCR验证，再通过回归分析建立基因表达与孵化率的定量关系，增强了结论可靠性。
   

其他发现

研究还指出，卵质差异可能源于母体激素处理或环境因素，但分子层面的具体诱因仍需进一步探究。此外，部分候选基因（如TTN）在肌肉发育中的作用提示母源转录本可能影响胚胎后期器官形成。