哺乳动物细胞中人源抗体的瞬时表达方案
作者： Rodrigo Vazquez-Lombardi¹, Damien Nevoltris¹, Ansha Luthra¹,², Peter Schofield¹,², Carsten Zimmermann³,⁴ & Daniel Christ¹,²
单位： ¹澳大利亚悉尼加文医学研究所免疫学部；²澳大利亚新南威尔士大学圣文森特临床学院；³美国圣地亚哥大学工商管理学院；⁴美国加州大学圣地亚哥分校雷迪管理学院
期刊： *Nature Protocols*，2018年第13卷第1期，2017年12月14日在线发表
一、学术背景
重组抗体及其衍生构建体的生产在学术研究中长期面临挑战，尤其在中小规模生产中。传统上以大肠杆菌（*Escherichia coli*）为主的细菌表达系统虽能有效表达单域抗体和单链可变区片段（scFv）等小分子抗体片段，但对于较大的抗体构建体——包括抗原结合片段（Fab）、可结晶片段（Fc）融合蛋白、双特异性抗体和全长免疫球蛋白G（IgG）——产率普遍偏低。更为关键的是，细菌表达系统存在三个本质性缺陷：其一，原核系统缺乏糖基化修饰能力，导致抗体免疫效应功能降低；其二，纯化产物易受细菌内毒素污染，可能激活先天免疫细胞、干扰细胞实验结果的解读，并在体内给药后产生致热效应；其三，酵母和昆虫细胞等真核替代系统虽然能进行糖基化，但其糖基化模式与哺乳动物存在显著差异，限制了其在临床前研究和人类生物制药开发中的应用。
近年来，悬浮适应且无血清的哺乳动物表达系统在学术界的可及性大幅提升。这些系统依赖支持高细胞密度（>1×10⁷细胞/mL）的培养基和转录增强剂，使重组抗体产率达到每升数十至数百毫克，部分研究甚至报道了超过1 g/L的预纯化产量。在此基础上，本文作者团队提供了详细的逐步方案，涵盖全长IgG、Fab片段、Fc融合蛋白和双特异性抗体构建体的设计与瞬时表达，并包括亲和层析纯化、内毒素检测与去除、以及生物层干涉测量（BLI）亲和力测定等完整流程，整个流程可在3周内完成。
二、实验设计与方法学流程
本方案的核心设计思路是利用基因合成外包策略构建抗体编码序列，随后亚克隆至哺乳动物表达载体pCEP4，通过瞬时转染悬浮适应的HEK293细胞（Expi293F）实现分泌表达，再经亲和层析纯化获得无内毒素的抗体试剂。
（一）抗体构建体设计原则
方案在Box 1中系统阐述了哺乳动物表达基因构建体的设计要求：首先，需在插入片段两端引入与pCEP4多克隆位点兼容的限制性酶切位点（本方案采用5′端KpnI和3′端BamHI）；其次，高效表达转基因的关键要素包括Kozak序列、N端信号肽（引导蛋白分泌至培养基）和C端终止密码子；其三，抗体可变区序列来源于人源化/人单克隆抗体或通过噬菌体展示等筛选技术获得的新特异性序列；其四，恒定区氨基酸序列可从UniProt等公共数据库获取，并需使用哺乳动物密码子表进行反向翻译以优化表达。
值得特别关注的是Fc区域来源的选择。人源与鼠源IgG的Fc区在结合鼠Fcγ受体方面存在差异，因而在小鼠疾病模型中表现出不同的Fc介导免疫效应功能水平。若需在小鼠模型中充分评估Fc介导的效应功能，建议使用来自鼠IgG2a（适用于BALB/c小鼠）或IgG2c（适用于C57BL/6小鼠）的Fc区；若在FcγR人源化小鼠或移植人类免疫细胞的免疫缺陷小鼠中进行实验，则可使用人IgG1来源的Fc区。若特定应用不需要Fc介导的效应功能，可在鼠IgG2a/c和人IgG1 Fc区中引入突变以破坏FcγR结合和/或补体激活。此外，C端六聚组氨酸标签（6×His）的引入使构建体可通过固定化金属亲和层析（IMAC）纯化，尤其适用于缺乏Fc区而无法用蛋白G层析纯化的Fab片段。由于Fab为单价分子，将His标签仅置于重链而轻链不带标签，转染过量轻链后再经IMAC纯化，即可确保仅纯化到完整组装的Fab。
（二）亚克隆与质粒DNA大规模制备（步骤1–18，7天）
基因合成产物通常以pUC18、pUC19或pUC57克隆载体形式交付。方案首先用高保真DNA聚合酶（NEB Phusion HF）进行PCR扩增插入片段，PCR体系中添加20%甲酰胺以改善GC富集区域的扩增特异性。扩增产物经DpnI消化去除模板DNA后，用KpnI-HF和BamHI-HF双酶切消化。载体pCEP4同时用KpnI-HF、XhoI和BamHI-HF三酶切消化，其中XhoI的额外切割位点位于克隆酶切位点之间，可降低载体自连接的概率。载体经小牛肠道碱性磷酸酶去磷酸化处理后，以3:1的插入片段/载体摩尔比进行T4 DNA连接酶连接。连接产物转化化学感受态大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄西林的LB琼脂平板。次日通过菌落PCR筛选阳性克隆，PCR产物经Sanger测序验证序列。验证正确的克隆制备甘油冻存液，并接种150 mL LB培养基进行过夜培养，最终使用含内毒素去除步骤的质粒纯化试剂盒（如ZymoPURE Maxiprep）提取质粒DNA。
（三）哺乳细胞分泌表达（步骤19–29，6天）
Expi293F细胞复苏后在Expi293无血清培养基中培养，每3–4天传代，维持细胞密度在3×10⁵至5×10⁶细胞/mL之间，建议使用第3至15代的细胞进行转染。转染前24小时将细胞密度调整至2×10⁶细胞/mL。转染当日，以30 mL转染体积为例，将75×10⁶细胞加入125 mL培养瓶并用培养基调整至25.5 mL。质粒DNA（30 μg总量）和转染试剂（ExpiFectamine 293，81 μL）分别用Opti-MEM I稀释后混合，室温孵育20分钟形成DNA-脂质复合物，随后逐滴加入细胞培养物中。转染后16–20小时添加增强剂I（150 μL）和增强剂II（1.5 mL），其中含有的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（如丙戊酸和丙酸钠）可促进转录激活，从而提高重组蛋白表达产量。转染后6–7天收获上清，离心去除细胞后经0.22 μm滤膜过滤。
方案特别强调了重链/轻链DNA转染比例的优化。30 mL转染体系中总DNA量固定为30 μg，无论是否共转染两个质粒。以IgG格式为例，重链（HC）的分泌依赖于轻链（LC）的存在，1:1的HC/LC比例通常可获得最高的完整IgG组装产率，而1:2和1:4比例分别导致17%和32%的产量下降。对于单价Fc融合蛋白的表达，需将Fc融合构建体与His标签Fc构建体共转染。
（四）抗体纯化（步骤30–35，2天）
纯化策略根据构建体特性选择蛋白A/G/L亲和层析或IMAC。蛋白G结合Fc区，蛋白L结合Vκ轻链结构域，蛋白A结合Fc区和VH3结构域。以蛋白G亲和层析为例：将1 mL树脂装入一次性重力流柱，经超纯水洗涤和低内毒素PBS平衡后，施加过滤上清，收集流穿液；用低内毒素PBS洗涤两次后，以甘氨酸-HCl洗脱缓冲液（pH 2.7）洗脱，收集至预装Tris-HCl中和液（pH 7.6）的无热原管中。对于带6×His标签的构建体（如Fab），使用TALON金属亲和树脂进行批次结合后装柱纯化，以含150 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱。纯化单价Fc融合蛋白时，需采用咪唑浓度递增的分步洗脱（5–50 mM，5 mM递增）以分离带单个His标签的单价Fc融合蛋白与带两个His标签的Fc-His同源二聚体；不带His标签的二价Fc融合蛋白则从流穿液中用蛋白G珠回收。所有洗脱组分经SDS-PAGE分析（非还原和还原条件），含目标蛋白的组分合并后透析至低内毒素PBS，用截留分子量≤10 kDa的离心浓缩器浓缩至0.5–1 mg/mL，最终经0.22 μm过滤后分装冻存于−80°C。
（五）内毒素检测与去除（步骤36–44，最多2天）
内毒素含量是用于体内模型的纯化抗体样品的关键质量指标。方案基于人体致热阈值为5 EU/kg/h的指南，推算30 g小鼠的每日内毒素上限为3.6 EU，即100 μL日注射量的内毒素上限为36 EU/mL（理想情况下<10 EU/mL）。内毒素检测使用QCL-1000显色LAL终点测定法，通过多稀释度测量确保处于检测动态范围。若内毒素超标，可采用强阴离子交换层析去除：将样品pH调至低于目标蛋白等电点（pI）但高于内毒素（通常具有低pI）的水平，使内毒素保持负电荷从而被阴离子交换介质捕获，而目标蛋白流穿通过。步骤包括测定蛋白理论pI、透析至pH调节的PBS、平衡HiTrap Capto Q柱、上样、复测内毒素含量，必要时重复处理。
（六）生物层干涉测量法测定抗原结合亲和力（步骤45–57，2天）
BLI基于生物传感器表面光波干涉图案的测量来检测分子相互作用。方案专门针对单价Fab形式的1:1结合动力学测定，以排除IgG双价结合带来的亲合力效应（avidity effect）对亲和力评估的干扰。操作流程包括：靶蛋白经NHS-PEG4-生物素以20倍摩尔过量进行生物素化标记，经脱盐柱去除游离生物素；链霉亲和素生物传感器在含1% BSA的PBS中再水化；在Blitz Pro软件中设置基线–加载–基线–结合–解离五步流程；先进行空白运行以确保负载信号至少达到1 nm且有清晰的平台期；随后以Fab浓度梯度（如4 μM四倍稀释至244 pM）进行系列运行；选取结合最高浓度达到最大信号（Rmax）至最低可检测信号之间的运行数据进行全局拟合分析，获得结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）和平衡解离常数（KD = kd/ka）。
三、质量验证结果
方案展示了纯化产物的多项质控数据。SDS-PAGE分析在非还原和还原条件下均显示预期条带：Herceptin IgG理论分子量为146 kDa（重链50 kDa + 轻链23 kDa），Fab为47 kDa（24 kDa + 23 kDa），IL-2-Fc为84 kDa，双特异性scFv为53 kDa。内毒素定量方面，对168 μg/mL的IL-2wtFc即用注射液测得内毒素含量为2.1 EU/mL（技术重复变异系数1.5%），低于小鼠实验的推荐阈值。BLI分析中，Herceptin IgG和Fab均显示与固定化HER2抗原的浓度依赖性结合，经1:1 Langmuir模型拟合，Fab片段的单价亲和力KD = 1.6 nM，而IgG的拟合涉及双价亲合力效应，因此方案强调以Fab格式测定真实单价亲和力。
四、结论与价值
该方案为学术研究环境中的重组抗体生产提供了一套系统化、标准化的操作流程。其核心价值体现在多个层面：在科学层面，哺乳动物表达系统提供了正确的糖基化修饰和极低的内毒素背景，保证了抗体的功能完整性和实验数据的可靠性；在方法学层面，基因合成外包与双质粒共转染策略的结合大大降低了技术门槛，使非抗体工程专业实验室也能高效生产多种格式的抗体构建体；在应用层面，该方案涵盖从基因设计到亲和力验证的完整管线，产物可直接用于结构生物学研究、亲和力测定和临床前动物实验。与细菌表达相比，哺乳动物表达的成本劣势在产量大幅提升的背景下被显著缩小。该方案的局限性主要在于阳离子脂质转染试剂的成本较高，若需>500 mL的大规模瞬时表达，建议考虑聚乙烯亚胺（PEI）等成本更低的替代方案；对于已选定的先导抗体候选物，则建议后续投资建立稳定细胞系以实现长期大规模生产。