本研究由Jian Zhou、Han Zhao、Lu Zhang、Xianlin Ye、Zhipeng Wang、Qiang Li、Hongyu Ke、Gang Zhao、Jun Du、Song Yang和Liulan Zhao等作者共同完成，分别来自四川省农业科学院水产研究所和四川农业大学动物科技学院。研究论文发表于《Comparative Biochemistry and Physiology - Part D》期刊，并于2020年2月10日在线发布。

学术背景

研究的主要科学领域为水产养殖中的免疫学，特别是针对长吻鮠（Leiocassis longirostris）在感染嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）后的免疫反应机制。嗜水气单胞菌是水产养殖中常见的病原菌，能够引发细菌性出血性败血症，导致严重的经济损失。长吻鮠是中国广泛养殖的鱼类，但其在养殖过程中易受此类感染，因此研究其免疫反应机制对疾病防控具有重要意义。研究旨在通过RNA测序（RNA-seq）和微小RNA测序（miRNA-seq）技术，揭示长吻鮠在感染嗜水气单胞菌后脾脏组织中mRNA和miRNA的变化，进而探讨其免疫反应的分子机制。

研究流程

研究共包括以下几个主要步骤：

1. 实验设计与样本采集
   研究选取了40条长吻鮠，平均体重为24.25±0.40 g，平均长度为11.75±0.30 cm。实验分为对照组（CG）和实验组（EG），每组20条鱼。实验组通过腹腔注射1.0×10⁷ CFU的嗜水气单胞菌悬浮液，对照组则注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS）。感染后，分别在0、4、8、12小时采集脾脏、肌肉和肠道样本，并立即冷冻保存用于后续RNA提取。

2. RNA提取与测序
   使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA完整性。高质量的RNA样本用于构建mRNA和miRNA测序文库，测序在Illumina HiSeq 2000平台上进行。mRNA测序共获得92.16（CG）和95.61（EG）百万条高质量转录组读段，miRNA测序则鉴定了343个miRNA。

3. 数据组装与注释
   使用Trinity软件对测序数据进行从头组装（de novo assembly），生成非冗余的转录本（unigenes）。通过NCBI非冗余蛋白数据库（nr）、COG数据库和KEGG数据库对转录本进行功能注释。GO功能分析和KEGG通路分析用于揭示差异表达基因（DEGs）的功能分类和代谢通路。

4. 差异表达分析
   使用DESeq软件对mRNA和miRNA的差异表达进行分析。筛选标准为|log2 ratio| ≥ 1且p ≤ 0.05。在mRNA测序中，共鉴定出392个差异表达基因，其中207个上调，185个下调。miRNA测序中，共鉴定出25个差异表达miRNA，其中15个上调，10个下调。

5. 目标基因预测与功能分析
   使用TargetScan和DIANA miRPath软件预测miRNA的靶基因，并进行KEGG通路富集分析。结果显示，靶基因主要富集在与免疫反应相关的13条通路中，包括mTOR信号通路和TGF-β信号通路。

6. 实时定量PCR验证
   通过实时定量PCR（qRT-PCR）验证了8个差异表达基因和4个miRNA的表达模式，结果显示qRT-PCR与RNA-seq数据高度一致（Pearson’s r = 0.848）。

主要结果

1. 差异表达基因的功能分析
   差异表达基因主要富集在29个GO条目和30个KEGG通路中，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、补体和凝血级联反应等。其中，17个上调基因和12个下调基因与免疫反应相关。热休克蛋白（HSP）家族中的HSP30在感染后显著上调，表明其在抗应激和免疫反应中的潜在作用。

2. miRNA的调控作用
   差异表达miRNA的靶基因主要富集在与细胞增殖、分化和疾病相关的通路中，如mTOR信号通路和TGF-β信号通路。研究发现，miR-140-3p和miR-140-5p在感染后显著上调，其靶基因TGFβR2的表达则显著下调，表明这些miRNA在免疫反应中发挥重要调控作用。

3. 免疫相关基因的表达模式
   qRT-PCR验证结果显示，免疫相关基因在感染后的表达水平随时间逐渐增加，表明这些基因在抗炎和免疫反应中具有潜在作用。

结论

本研究通过RNA-seq和miRNA-seq技术，系统揭示了长吻鮠在感染嗜水气单胞菌后的免疫反应机制。研究发现，感染后多个免疫相关基因和miRNA的表达发生显著变化，特别是HSP30、TGFβR2等基因在抗应激和免疫调控中发挥重要作用。这些结果为深入理解长吻鮠的免疫机制提供了重要线索，并为通过遗传改良提高其抗病能力奠定了基础。

研究亮点

1. 创新性方法：首次结合RNA-seq和miRNA-seq技术，系统分析长吻鮠在细菌感染后的免疫反应机制。
2. 重要发现：揭示了多个与免疫反应相关的关键基因和miRNA，特别是HSP30和TGFβR2在抗应激和免疫调控中的重要作用。
3. 应用价值：研究结果为长吻鮠的抗病育种提供了分子基础，有助于提高其养殖效益和疾病防控能力。

其他有价值的内容

研究还发现，长吻鮠的免疫反应涉及多个信号通路，包括mTOR信号通路和TGF-β信号通路，这些通路的调控机制为进一步研究提供了新的方向。此外，研究通过qRT-PCR验证了RNA-seq数据的可靠性，为后续研究提供了可靠的技术支持。