关于从贝莱斯芽孢杆菌DJ1中分离鉴定抗真菌聚酮类化合物及其玉米茎腐病生防潜力的研究报告

本文旨在向国内科研同行介绍一篇近期发表的原创性研究成果。该研究由孙萌、杜婉佳、张家玲、徐岩、王子瑄、周璐、严庚璇*和张淑梅*（通讯作者，均来自黑龙江省科学院微生物研究所）共同完成，研究论文题为《Isolation and Identification of Antifungal Polyketones from Bacillus velezensis DJ1 and Their Biocontrol Potential Against Corn Stalk Rot》，于2025年10月17日在学术期刊 《Biology》 2025年第14卷第1436期上发表。

一、 研究的学术背景

本研究隶属于农业微生物学与植物病害生物防治交叉领域。其核心背景是：玉米作为全球重要的粮食和经济作物，长期受到由禾谷镰刀菌（*Fusarium graminearum*）引起的玉米茎腐病的严重威胁，导致巨大的产量损失。长期以来，化学杀菌剂是防治该病的主要手段，但长期大量使用不仅导致病原菌产生抗药性，更引发土壤污染和生态风险。因此，开发环境友好、靶向性强且不易诱发抗性的生物防治剂（Biocontrol Agents, BCAs）成为当前玉米病害防控研究的核心方向。

在众多候选生防微生物中，芽孢杆菌属（Bacillus spp.）因其卓越的抗逆性、广泛的宿主适应性和良好的生物安全性而备受关注。这类细菌能够合成多种具有抗菌活性的生物活性代谢物。其中，聚酮类化合物（Polyketones）是一类通过聚酮合酶（Polyketide Synthase， PKS）途径生物合成的大规模、结构多样的天然产物，例如杆菌烯（bacillaene）、地非西丁（difficidin）和大环内酯（macrolactin）等。已有证据表明芽孢杆菌来源的聚酮类化合物对多种植物病原微生物具有强大的抑制效果。然而，关于贝莱斯芽孢杆菌（*Bacillus velezensis*） 产生的聚酮类化合物对禾谷镰刀菌的抗真菌活性及其在玉米茎腐病生防中的应用潜力，相关研究仍非常有限。

本研究所用的贝莱斯芽孢杆菌DJ1菌株（保藏号：CGMCC No. 25972） 前期从白菜根际土壤中分离获得。前期筛选发现其对禾谷镰刀菌的抑制活性强于其他12个测试菌株。全基因组测序显示DJ1拥有完整的PKS基因簇，证实了其合成聚酮类化合物的能力。基于以上背景，本研究提出了核心假设：DJ1菌株产生的聚酮类代谢物是其对禾谷镰刀菌表现出抗真菌活性的主要贡献者。 研究目标旨在：1）从DJ1发酵液中分离纯化具有生物活性的聚酮类组分并鉴定其结构；2）系统评估其在体外和温室条件下的抗真菌功效；3）通过考察这些聚酮类化合物对禾谷镰刀菌细胞形态和膜完整性的影响，探究其潜在作用机制。最终，为贝莱斯芽孢杆菌DJ1及其聚酮类代谢物在玉米茎腐病生物防治中的靶向应用提供理论依据。

二、 详细的研究流程

本研究采用了多步骤、系统性的实验流程，涵盖了从活性物质分离、机理探究到应用验证的完整链条。主要流程及细节如下：

1. 聚酮类化合物的制备：研究使用LB培养基进行发酵生产。将DJ1单菌落接种至LB培养基，37°C培养12小时获得种子液，再以2%（v/v）的接种量转接至新鲜LB培养基，于37°C、180 rpm振荡培养48小时。培养物经离心获取上清液，与异丙醇以1:4（v/v）比例混合，持续搅拌萃取2小时。有机相在40°C减压旋转蒸发浓缩，所得沉淀用少量甲醇复溶，用于后续分析。

2. DJ1聚酮类化合物的抗真菌活性测定：采用平板抑制法评估活性。将不同浓度（0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 25 mg mL⁻¹）的聚酮粗提物加入PDA培养基中，以等体积甲醇作为对照。在每个平板中央接种一个直径为7 mm的禾谷镰刀菌菌饼，28°C黑暗培养7天。通过测量菌落直径，按公式计算菌丝生长抑制率。同时，测定最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最小杀菌浓度（Minimum Fungicidal Concentration, MFC）以评估提取物的抗真菌效力。

3. DJ1聚酮类化合物对禾谷镰刀菌的抑制机制研究：

   • 菌丝形态影响：在添加了MIC浓度（5 mg mL⁻¹）DJ1聚酮粗提物的PDA平板上培养禾谷镰刀菌，以未添加提取物的平板作为对照。取处理后的菌丝样本，经2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脱水、喷金处理后，使用扫描电子显微镜（SEM， Hitachi H-600）观察菌丝形态的微观变化。
   • 细胞膜完整性破坏：将禾谷镰刀菌孢子（1 × 10⁶ CFU/mL）接种于含有1×MIC和2×MIC浓度聚酮类化合物的PDB培养基中，28°C培养48小时。培养结束后离心取上清液，测定其在260 nm（核酸特征吸收波长）和280 nm（蛋白质特征吸收波长）处的吸光度，以评估细胞内核酸和蛋白质的泄漏情况。
   • 关键酶活性测定：在PDB培养基中培养禾谷镰刀菌，待菌丝生长后，分别加入0（对照）和1×MIC浓度的聚酮提取物。在添加后的0、12、24和48小时取样，使用相应试剂盒测定病原菌菌丝体内苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia-Lyase, PAL）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）和过氧化物酶（Peroxidase, POD）的活性。每个处理设置三个生物学重复。

4. 温室盆栽实验验证生防效果：在温室条件下进行玉米茎腐病防治效果验证。实验设置四个处理：A. 仅接种病原菌孢子悬浮液（1 × 10⁶ 孢子·mL⁻¹）；B. 先喷施DJ1聚酮提取物，24小时后接种病原菌；C. 接种无菌水（阴性对照）；D. 喷施25%氟啶胺悬浮液（化学药剂对照）。所有处理均采用茎基部注射法接种。定期观察直至病症出现，根据玉米茎腐病分级标准评估病情，计算发病率、病情指数和防治效果。

5. 土壤宏基因组测序分析：为探究DJ1聚酮类化合物对玉米根际土壤微生物群落的影响，设置两个处理：聚酮处理组（T）和等体积甲醇对照组（CK）。每个处理5个生物学重复。在接种后30天收集根际土壤，提取土壤DNA进行高通量测序（由广州美格生物技术有限公司完成）。细菌群落扩增使用通用引物对341F/805R，文库在Illumina HiSeq平台上机测序。按照既定协议分析土壤微生物群落结构和功能谱。

6. DJ1聚酮类活性成分的鉴定：采用高效液相色谱（HPLC）系统对目标聚酮类化合物进行分离纯化。色谱条件为：C18反相柱，流动相为含0.1%甲酸的甲醇和ddH₂O，梯度洗脱，检测波长273 nm。为进行结构鉴定，HPLC系统在线联用高分辨质谱（MS）系统（Synapt G2 HDMS Q-TOF）。质谱分析在负电喷雾电离（ESI⁻）模式下进行，所有获取的质谱数据使用MassLynx™ 4.1软件处理。

7. 数据分析：实验数据的统计分析使用SPSS 26.0软件进行，显著性阈值设定为p < 0.05。采用Duncan多重范围检验评估组间差异。使用GraphPad Prism 8.0进行数据可视化。

三、 主要研究结果

1. 抗真菌活性测定结果：DJ1来源的聚酮类提取物对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制呈现显著的剂量依赖效应。培养第2天，浓度为25.0、20.0、10.0和5.0 mg/mL的提取物对禾谷镰刀菌的抑制率均达到100%。据此，确定其最小抑菌浓度（MIC）为5 mg/mL。培养7天后，仅25.0 mg/mL浓度组维持100%抑制率，因此确定其最小杀菌浓度（MFC）为25.0 mg/mL。这为后续机理研究和应用浓度选择提供了直接依据。

2. 抑制机制研究结果：

   • 形态学破坏：SEM观察显示，未经处理的禾谷镰刀菌菌丝生长正常、结构完整。而经MIC浓度DJ1聚酮处理后，菌丝发生明显塌陷，细胞结构被破坏。这直观证实了聚酮类化合物通过破坏病原菌细胞形态发挥抑菌作用。
   • 细胞膜损伤：生化分析表明，随着聚酮类化合物浓度的增加，禾谷镰刀菌细胞外核酸（OD260）和蛋白质（OD280）的泄漏量显著增加，呈现剂量依赖性。这直接证明了DJ1聚酮能够破坏禾谷镰刀菌的细胞膜完整性，导致关键生物大分子流失，进而引起代谢紊乱甚至死亡。
   • 关键酶活性扰动：在整个处理期间，处理组禾谷镰刀菌的PAL活性始终显著高于对照组，表明聚酮处理激活了病原菌的苯丙氨酸解氨酶途径，这可能是病原菌试图通过增强细胞壁合成（如黑色素）来抵御胁迫的应激反应。处理组SOD活性也显著上调，说明病原菌激活了抗氧化防御系统以清除聚酮可能诱导的活性氧（ROS），但这种上调可能不足以完全抵消氧化损伤。POD活性呈现先升高后降低的动态变化，且始终高于对照组，其早期升高可能与增强抗氧化能力和通过木质化修复细胞壁损伤有关，后期下降可能与膜损伤导致的原料流失或ROS对酶结构的破坏有关。这些酶活性的异常变化，从代谢干扰层面构成了聚酮抑制病原菌生长的重要途径。

3. 温室防治效果结果：盆栽实验表明，与仅接种病原菌的处理相比，施用DJ1聚酮提取物和化学药剂氟啶胺的处理，其玉米茎腐病的发病率和病情指数均显著降低。DJ1聚酮处理组的病害防治效果达到44.33%，且与化学药剂处理组的防治效果无显著差异。这直接证明了DJ1聚酮类化合物在活体植株水平上具有可观的生防潜力，可作为化学杀菌剂的潜在替代品。

4. 对根际微生物群落的影响：土壤宏基因组测序分析显示，施用DJ1聚酮类化合物并未对根际细菌群落的整体丰富度（Chao1指数）、多样性（Shannon指数）或结构（基于Bray-Curtis距离的PCoA分析）产生显著干扰。这表明DJ1聚酮对土壤原生微生物群落相对友好，降低了破坏土壤固有生态平衡的风险。在具体类群上，处理组中拟杆菌门（Bacteroidota）和属水平上的DYGX01的相对丰度显著高于对照组。拟杆菌门成员通常参与有机物降解，其丰度增加可能暗示聚酮处理增强了土壤分解某些有机物质的能力。DYGX01的丰度变化表明其对DJ1聚酮有特异性响应，但该属的功能特性目前文献中尚无直接报道，是一个值得深入的研究方向。

5. 活性成分鉴定结果：通过活性引导分离策略和HPLC-MS分析，从DJ1的粗提物中成功分离并鉴定出两个高纯度的活性成分。通过与标准品和文献数据的质谱对比，最终确定这两个活性成分为地非西丁（difficidin， 分子量544）和杆菌烯（bacillaene， 分子量582）。这一结果与前期全基因组测序预测的PKS基因簇信息相符，也与其他芽孢杆菌研究中对这两种化合物抗菌作用的报道一致，证实了它们是DJ1抑菌活性的关键物质基础。

四、 研究结论

本研究系统性地探讨了贝莱斯芽孢杆菌DJ1来源的聚酮类化合物对玉米茎腐病病原菌禾谷镰刀菌的抗真菌潜力及其作用机制。得出结论：DJ1聚酮类化合物具有剂量依赖性的抗真菌活性，其MIC和MFC分别为5 mg/mL和25 mg/mL。它们通过破坏禾谷镰刀菌的菌丝形态、损害细胞膜完整性、引起核酸和蛋白质泄漏以及造成氧化损伤等多重机制抑制病原菌。在温室条件下，DJ1聚酮类化合物能有效降低玉米茎腐病的发生，防治效果达44.33%。土壤微生物群落分析表明，DJ1聚酮不会显著扰乱根际细菌群落的整体平衡，但特异性地提高了拟杆菌门和DYGX01属的相对丰度。活性成分鉴定证实其主要为地非西丁和杆菌烯。DJ1来源的聚酮类化合物是防治玉米茎腐病的潜在生防剂，为可持续农业病害管理提供了一种环境友好的新策略。

五、 研究亮点

1. 系统性与完整性：研究涵盖了从活性物质分离、结构鉴定、体外抑菌机理（形态、膜损伤、酶活）、温室防效验证到环境安全性（根际微生物影响）评估的全链条，对DJ1聚酮的生防潜力进行了多维度的系统评价。
2. 机理探究深入：不仅通过SEM直观展示了菌丝形态破坏，还通过生化手段定量证明了细胞膜损伤（核酸蛋白泄漏），并进一步探究了对病原菌关键防御酶系（PAL、SOD、POD）的扰动，从物理结构破坏和生理代谢干扰两个层面阐明了其抑菌机制。
3. 关注环境生态效应：创新性地通过土壤宏基因组测序，评估了生防物质施用对根际微生物群落的影响，为评价其生态安全性提供了重要数据，体现了可持续植保的理念。
4. 明确的活性成分指向：采用活性引导分离结合HPLC-HDMS Q-TOF技术，准确鉴定出地非西丁和杆菌烯为关键活性成分，将菌株的生防特性与具体的代谢产物直接关联，为后续作用机制深度解析和产品开发奠定了坚实基础。
5. 潜在应用价值突出：温室防治效果与化学药剂相当，且对土壤微生物群落干扰小，凸显了其作为化学杀菌剂替代品的巨大潜力，为解决玉米茎腐病防控中的抗药性和环境污染问题提供了新的解决方案。

六、 其他有价值的内容

论文在讨论部分还指出了本研究的局限性和未来方向：例如，温室条件环境可控，与田间多变环境存在差异，后续需要进行田间规模试验以进一步验证其在实际农业生产条件下的表现。此外，针对已鉴定的活性成分地非西丁和杆菌烯在田间条件下稳定性可能不佳的瓶颈，作者建议未来可通过优化制剂技术（如选用壳聚糖、海藻酸钠-蒙脱土等复合载体）或进行靶向分子结构修饰等策略，以提高其稳定性，从而推动其实际应用。这些思考为该领域的后续研究指明了有价值的技术攻关方向。