本研究由Kunyan Zou（潍坊大学机械与自动化系）、Yang Jae Kang（韩国庆尚国立大学生物与医学大数据部）、Bo-Keun Ha（韩国全南大学应用植物科学系）、Kyung Do Kim（韩国世宗大学综合生物科学与产业系）、Ki-Seung Kim（韩国FarmHannong有限公司新农药研究所）及Tae-Hwan Jun（韩国釜山国立大学植物生物科学系）共同完成，发表于2025年11月27日的《Frontiers in Plant Science》期刊（DOI: 10.3389/fpls.2025.1699469）。
学术背景
花生（Arachis hypogaea L.）是全球重要的油料和豆科作物，但土壤盐渍化严重威胁其生产。盐胁迫通过渗透胁迫和离子毒性影响种子萌发、幼苗生长及发育，导致光合作用受阻和产量下降。尽管花生基因组测序已完成，但其耐盐遗传机制仍不明确。本研究旨在通过全基因组关联分析（GWAS）和转录组测序（RNA-seq）整合策略，鉴定花生耐盐相关候选基因，开发分子标记，为耐盐品种选育提供理论依据。
研究流程
材料与表型分析
- 研究对象：295份花生种质资源，种植于韩国釜山国立大学温室，设置5个生物学重复。
- 盐处理：幼苗期用200 mM NaCl处理10天，以无NaCl的Hoagland溶液为对照。
- 表型指标：叶片灼伤评分（LSS，1-5级）、钠离子浓度、脯氨酸含量、叶绿素含量（SPAD-502测定）。
- 极端材料筛选：根据表型数据选择耐盐型（GWP331）和敏感型（GWP161）进行RNA-seq分析。
全基因组关联分析（GWAS）
- 基因型数据：使用58,000个SNP的Axiom_Arachis芯片，参考基因组为Arahy.Tifrunner.gnm1.KYV3。
- 分析方法：采用GAPIT软件（版本3）的ECMLM模型，Bonferroni校正显著性阈值（p=4.74×10⁻⁶）。
- LD分析：通过Haploview v4.2构建连锁不平衡区块（平均衰减距离150 kb），筛选±500 kb内候选基因。
转录组测序（RNA-seq）
- 样本处理：耐盐/敏感型根系在盐处理0、12、24小时后取样，Illumina NovaSeq 6000平台测序。
- 数据分析：Trimmomatic去低质量序列，Kallisto比对，DESeq2鉴定差异基因（DEGs，|log2FC|>2，FDR≤0.05）。
- 功能注释：GO和KEGG富集分析，Cytoscape构建共表达网络。
候选基因验证
- qRT-PCR：对17个GWAS与RNA-seq共定位基因进行表达验证，Actin为内参。
- 序列变异检测：Sanger测序分析耐盐/敏感型候选基因的启动子和编码区突变。
- KASP标记开发：基于SNP ax-147250101设计竞争性等位基因特异性PCR标记，用于脯氨酸含量分型。
主要结果
表型变异
- 钠离子含量变化范围0.30–2.48 g/L，脯氨酸含量0.0014–0.0259 g/g FW，LSS平均2.98。PCA分析将种质分为耐盐与敏感两类（K=2）。
GWAS结果
- 鉴定到10个显著SNP，其中5个与钠离子含量相关（如ax-176794398位于Aradu.A01），2个与脯氨酸含量相关（如ax-147250101位于Araip.B05），3个与LSS相关。
转录组分析
- 发现1,734个DEGs，富集于氧化还原活性（GO:0016491）、类黄酮生物合成（ko00941）等通路。7个候选基因（如LOC112797053和LOC112750632）在耐盐型中显著差异表达。
功能验证
- LOC112797053（编码丙二酰-CoA:花青素-5-O-葡萄糖苷-6”-O-丙二酰转移酶）启动子区存在碱基替换；LOC112750632（核融合缺陷蛋白4）含启动子SNP。KASP标记ax-147250101可有效区分93.3%高脯氨酸含量基因型。
结论与价值
科学价值
- 首次通过GWAS与RNA-seq整合策略定位花生耐盐基因，揭示氧化还原和类黄酮代谢通路的关键作用。
- 发现LOC112797053可能通过花青素修饰调控ROS清除，LOC112750632参与核融合与盐胁迫响应。
应用价值
- KASP标记ax-147250101可加速耐盐品种选育，减少田间筛选成本。
- 提供的295份种质表型与基因型数据为后续研究奠定基础。
研究亮点
- 方法创新：结合GWAS（21,014个SNP）与多时间点RNA-seq，提高候选基因筛选精度。
- 新基因发现：鉴定到7个与耐盐显著相关的基因，其中2个含功能变异。
- 标记开发：首次开发花生耐盐相关KASP标记，实现分子辅助育种。
其他价值
本研究为多倍体作物复杂性状解析提供了范例，其整合分析框架可推广至其他逆境研究。数据已公开于韩国国家农业生物信息中心（NABIc，登录号nn-8235至nn-8246）。