本文属于类型b，是一篇由Serge Muyldermans撰写的综述性论文。作者来自比利时布鲁塞尔自由大学细胞与分子免疫学实验室及中国大连理工大学生物工程学院分子识别与成像辽宁重点实验室。该文发表于《The FEBS Journal》2021年第288卷，系统回顾了纳米抗体（nanobody, nb）的生成与设计策略及其广泛应用。文章围绕纳米抗体的来源、文库构建、筛选方法、工程化改造以及应用领域展开，旨在为研究者提供从文库构建到实际应用的全面指南。

文章首先介绍了纳米抗体的基本概念。纳米抗体源自骆驼科动物体内天然存在的重链抗体（heavy chain-only antibodies, hcabs），由单一可变结构域（variable domain of the heavy chain of heavy chain-only antibodies, vhh）组成，分子量小、稳定性高、特异性强。与传统的由重链和轻链组成的异四聚体抗体相比，纳米抗体更易于在微生物中重组表达，且因其单域结构而避免了单链可变区片段（single-chain variable fragment, scfv）常见的聚集或自发二聚化问题。该综述指出，纳米抗体的这些特性使其成为研究和治疗领域中极具吸引力的亲和试剂。

文章的核心内容之一是纳米抗体文库的构建。作者将文库分为免疫文库（immune library）、天然文库（naïve library）和合成文库（synthetic library）三类，并分别阐述了它们的特点和适用场景。免疫文库通过免疫骆驼科动物获得，通常只需50至100毫升血液即可构建，文库质量高、筛选成功率高，但需要动物免疫步骤。天然文库则从多只未免疫动物的血液中构建，避免了免疫过程，适用于毒性强或无免疫原性的靶标，但所需文库规模极大，通常需109至1011个克隆，且建库难度较高。合成文库则基于已知的稳定纳米抗体骨架，通过对其互补决定区（complementarity determining regions, cdrs）进行定点随机化构建，理论多样性极高，且不依赖动物免疫。文章详细介绍了免疫文库构建中的两步巢式pcr（nested pcr）策略：第一轮pcr扩增所有igg重链的vh-ch1-hinge编码片段和hcabs的vhh-hinge编码片段，由于后者缺少ch1外显子而片段更短，经琼脂糖凝胶电泳分离后作为第二轮pcr模板，最终获得vhh基因。此外，作者还提到了利用golden gate克隆技术提高文库中带有正确插入片段克隆的比例。合成文库的构建则利用三核苷酸模块（trinucleotide building blocks）控制cdr区氨基酸多样性和长度分布，从而保证文库质量。

在纳米抗体筛选方面，文章详细讨论了噬菌体展示（phage display）、酵母展示（yeast display）、细菌展示（bacterial display）、核糖体展示（ribosome display）等技术。噬菌体展示是最成熟、最常用的方法，尤其在与免疫文库结合时，针对蛋白类靶标的筛选成功率接近100%。噬菌体展示系统中的琥珀终止密码子设计可避免筛选过程中的多价效应，但m13噬菌体本身具有粘性且易受损，可能影响筛选效率。酵母展示和细菌展示结合流式细胞术（facs）或磁珠分选（macs）能够进行更精细的筛选，并可实现多重标记和构象选择性筛选，但这类系统操作更复杂、培养周期更长。近年来发展出的nestlink技术通过将纳米抗体与基因编码的条形码肽段连接，结合深度测序和质谱鉴定，实现了对结合物解离速率的排序，并可用于完整生物体内的筛选。文章还提到深度测序可直接用于免疫文库中潜在结合物的鉴定，但其结果受b细胞增殖和免疫原性差异影响，不一定直接反映靶标特异性。

在纳米抗体的工程化改造方面，文章系统介绍了人源化、基因融合、化学交联和酶介导偶联等策略。对于治疗用途，人源化是常规步骤，需保留框架区2中的四个vhh标志性氨基酸（f/y42、g/q49、r50、g52），同时将其他氨基酸替换为人源vh序列对应残基。基因融合策略极为灵活，例如将两个相同纳米抗体串联形成二价构建体以提高功能性亲和力，或融合两个识别不同表位的纳米抗体形成双表位构建体，或构建双特异性纳米抗体用于t细胞衔接（bispecific t-cell engagers, bites）。融合抗白蛋白纳米抗体可延长血液循环时间，但其代价是组织穿透能力下降。此外，纳米抗体还可与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶融合用于elisa检测，与荧光蛋白融合形成chromobody用于活细胞内靶标示踪，与毒素或fc片段融合用于治疗。酶介导偶联方面，sortase a、fge酶（formyl-glycine generating enzyme）和oaaep1等提供了位点特异性偶联的途径，其中fge可将特定标签肽中的半胱氨酸转化为醛基，从而实现正交偶联。化学交联方法虽然简单，但可能因赖氨酸随机修饰而影响纳米抗体活性。

文章还详细阐述了纳米抗体在多个领域中的应用价值。在基础研究中，纳米抗体被广泛用于靶标蛋白的结晶伴侣，已帮助解析了超过200个蛋白质晶体结构。通过胞内表达，纳米抗体可用于敲除或调控内源靶蛋白功能、追踪靶蛋白动态定位以及超分辨率显微成像。在诊断领域，纳米抗体因其高稳定性、低成本和易于定向固定而适用于侧向层析检测（lateral flow assay）和电化学传感器。在体内诊断中，纳米抗体因其快速外渗、深层组织渗透和快速肾脏清除特性，成为spect/ct或pet/ct示踪剂的理想选择，其中靶向her2的纳米抗体已通过i期临床试验。在治疗领域，caplacizumab作为首个获得ema和fda批准的二价纳米抗体药物，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜。此外，纳米抗体还被用于靶向放射性核素治疗（targeted radionuclide therapy, trnt）、嵌合抗原受体t细胞（car-t）治疗、抗病毒和抗蛇毒等方向。在农业生物技术方面，纳米抗体可保护植物免受真菌和病毒感染，并能通过植物种子表达用于仔猪的被动免疫。

总体而言，本文系统总结了纳米抗体从文库构建、筛选到工程化改造和应用的全流程技术路线，强调了免疫文库和噬菌体展示组合的高效性，也讨论了非免疫文库和新型筛选技术的潜力与挑战。文章的价值在于为不同背景的研究者提供了实用的技术指南，清晰地比较了各类文库和筛选策略的优缺点，并指出了纳米抗体在诊断、治疗和农业等领域中相较于传统抗体的独特优势。其论述层次分明，既有技术细节支撑，也有应用前景分析，对从事抗体工程、结构生物学、诊断试剂开发和治疗药物研发的科研人员具有较高的参考价值。