本研究由中国江南大学生物技术学院碳水化合物化学与生物技术教育部重点实验室的罗伟（Wei Luo）教授课题组主导完成。合作作者包括江南大学的王科（Ke Wang）、崔博雅（Boya Cui），莆田大学的宋西彤（Xitong Song），以及美国加州大学戴维斯分校的王毅（Yi Wang）*。该研究成果于2024年12月26日在线发表于美国化学学会旗下的《农业与食品化学杂志》（*Journal of Agricultural and Food Chemistry*），并于2025年正式刊出（卷73，页码646-654）。
研究背景与目标
本研究属于代谢工程与合成生物学领域，聚焦于高附加值相容性溶质——四氢嘧啶（Ectoine）的高效微生物合成。四氢嘧啶是一种源于天冬氨酸的环状氨基酸衍生物，因其独特的分子特性，能够在渗透胁迫下稳定蛋白质、核酸和细胞膜结构，在化妆品（如保湿霜、防晒剂）、医药（如治疗特应性皮炎、过敏、阿尔茨海默症）以及食品工业（作为天然防腐剂）中具有广泛应用前景。传统上，四氢嘧啶依赖嗜盐细菌（如*Halomonas elongata*）通过“细菌挤奶”工艺生产，但该过程存在发酵工艺复杂、设备腐蚀严重等瓶颈。相比之下，大肠杆菌（*Escherichia coli*）因其遗传背景清晰、繁殖周期短、易于基因操作，被视为理想的生物制造底盘细胞。然而，将异源的四氢嘧啶合成途径导入大肠杆菌面临代谢流分布复杂、副产物积累等诸多挑战，限制了其产量。
基于此，本研究旨在通过系统性的代谢工程策略，对大肠杆菌BL21(DE3)进行改造，以实现从葡萄糖高效合成四氢嘧啶。具体研究目标包括：1）构建并优化异源四氢嘧啶合成途径；2）弱化或敲除竞争性代谢支路；3）强化关键前体物（天冬氨酸-β-半醛、天冬氨酸、草酰乙酸）的供应；4）优化关键酶基因的拷贝数；5）通过辅因子工程平衡ATP和NADPH水平；最终通过组合优化策略，构建高产工程菌株并进行发酵验证。
详细工作流程
本研究遵循了典型的代谢工程“设计-构建-测试-学习”（DBTL）循环，工作流程系统且层层递进。
第一，异源合成途径的构建与初优化。 研究人员首先从嗜盐菌H. elongata DSM2581中获取了四氢嘧啶合成基因簇*ectABC*（分别编码二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、二氨基丁酸转氨酶EctB和四氢嘧啶合酶EctC）。为评估表达水平的影响，他们构建了多个重组质粒：将原始序列和密码子优化后的*ectABC*分别装载到中拷贝质粒pETDuet-1上，得到菌株C2和C1；将原始序列装载到高拷贝质粒pRSFDuet-1上，得到菌株C3。这些质粒被转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，在摇瓶中进行培养和诱导表达。此外，基于文献报道EctB可能是限速步骤，研究还构建了增加*ectB*拷贝数的菌株C4。所有菌株在相同条件下发酵72小时后，通过高效液相色谱（HPLC）检测四氢嘧啶浓度，并通过紫外分光光度计测量生物量（OD600）。
第二，竞争性代谢支路的弱化与敲除。 由于四氢嘧啶的前体天冬氨酸-β-半醛也是合成L-高丝氨酸和L-赖氨酸的共同前体，因此需要削弱这些竞争途径。大肠杆菌中的*thrA*基因编码具有双重功能的酶：天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶。直接敲除*thrA*是致命的。研究采用了一种巧妙的“截短”策略：仅保留*thrA*基因编码的前470个氨基酸，使其失去高丝氨酸脱氢酶活性，但保留天冬氨酸激酶I功能，此截短版本记为*thrA**。同时，为阻断赖氨酸合成，敲除了编码二氨基庚二酸脱羧酶的*lysA*基因。通过基于CRISPR-Cas9的双质粒基因编辑系统（参考文献35中的pECCas/pTargetF改进系统），在BL21(DE3)背景中依次进行了*thrA*截短和*lysA*敲除，构建了菌株C5和C6。该系统利用在线工具设计sgRNA，通过重叠PCR构建敲除盒，与pECCas9质粒共转化实现精确编辑，最后通过添加鼠李糖和蔗糖进行质粒消除。构建好的工程菌株再转入之前确定的最佳表达质粒（pRSFDuet-*ectABC*）进行表型测试。
第三，前体代谢通路的强化。 此阶段工作聚焦于增强天冬氨酸-β-半醛、天冬氨酸和草酰乙酸的供应。首先，尝试在菌株C6染色体上过表达编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的*asd*基因（构建菌株C7），但效果不佳。随后，重点优化天冬氨酸激酶的供应。研究人员将截短的*thrA**基因以不同拷贝数（1-4个）整合到染色体特定位点（如caIB, nmpC, *arpB*），构建了菌株C8、C9、C10，以寻找最佳拷贝数。其次，强化天冬氨酸的合成。大肠杆菌中天冬氨酸可由天冬氨酸酶（AspA）催化延胡索酸生成，或由天冬氨酸氨基转移酶（AspC）催化草酰乙酸生成。研究在C8菌株背景下，分别单独和组合过表达了*aspa*和*aspc*基因（构建C11， C12， C13）。此外，敲除了异柠檬酸裂解酶调节因子基因*iclr*（构建C14），以解除其对乙醛酸循环的抑制，从而可能间接增加草酰乙酸库。接着，在确定了AspA的显著贡献后，进一步优化了*aspa*的拷贝数（构建C15， C16）。最后，强化草酰乙酸的供应。研究比较了两种策略：一是在C14基础上敲除丙酮酸激酶基因*pykF*并过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因*ppc*（构建C17， C18）；二是引入来自谷氨酸棒杆菌（*Corynebacterium glutamicum*）的丙酮酸羧化酶基因*pyc*，构建一条新的从丙酮酸到草酰乙酸的途径（构建C19）。每个构建的菌株均通过摇瓶发酵评估四氢嘧啶产量和生长情况。
第四，辅因子与ATP供应的增强。 四氢嘧啶的生物合成消耗大量ATP和还原型辅酶II（NADPH）。为解决可能存在的辅因子瓶颈，研究人员进行了辅因子工程。在菌株C19的基础上，敲除了编码AMP核苷酶的*amn*基因，以减少ATP的无效水解（构建C20）；同时，过表达编码吡啶核苷酸转氢酶的*pntAB*基因，以促进NADPH的再生（构建C21）。这些操作旨在从“节流”和“开源”两个角度平衡细胞内的能量和还原力水平。
第五，组合优化与放大发酵验证。 在获得各模块最优策略后，研究将所有有益突变组合到单一菌株中。这是一个逐步累加的过程：从C21开始，依次整合最优拷贝数的*thrA**和*aspa*、*pyc*途径以及*pntAB*过表达，并最终在*pykF*位点整合了*ppc*基因，构建了最终的高产菌株C24。每一步组合都通过摇瓶实验验证了产量的叠加效应。最后，为了验证工程菌株在可控发酵条件下的生产能力，将C24菌株在5升发酵罐中进行补料分批发酵。发酵过程严格控制pH（7.0）、溶氧（>30%）、温度和葡萄糖浓度（维持在1 g/L）。当菌体密度（OD600）达到15时，降温至30℃并添加IPTG诱导四氢嘧啶合成。定期取样，使用生物传感器和HPLC分别监测葡萄糖消耗和四氢嘧啶积累。
主要研究结果
首先，在途径构建初优化阶段， 结果显示，使用高拷贝质粒pRSFDuet-1携带原始*ectABC*基因的菌株C3产量最高，优于使用中拷贝质粒的C2以及使用密码子优化基因的C1。这表明高水平的*ectABC*表达有利于四氢嘧啶合成，但C3的生物量略低，提示高拷贝质粒带来了生长负担。值得注意的是，增加*ectB*拷贝数的菌株C4产量反而下降，表明EctA、EctB、EctC三者之间的表达平衡比单纯提高某一个更为关键。
其次，在弱化竞争途径后， 菌株C5（*thrA*截短）和C6（*thrA*截短且*lysA*敲除）在生物量与对照C3相近的情况下，四氢嘧啶产量分别提高了18.9%和27.5%。这一结果清晰地证明，将碳代谢流从高丝氨酸和赖氨酸合成途径重定向至四氢嘧啶合成途径是有效的工程策略，且*thrA*截短是一种可行的替代直接敲除的方法。
第三，在前体强化阶段， 结果呈现出复杂性。过表达*asd*（菌株C7）导致产量和生长均下降，表明在该体系中*asd*并非限速步骤，其过度表达可能扰乱了代谢平衡。而过表达*thrA**的结果显示，拷贝数与产量之间存在先升后降的关系，拥有三个拷贝的菌株C9产量最高，比C6提高了32.2%，说明天冬氨酸激酶的供应是重要的限制因素，但过犹不及。在天冬氨酸供应方面，单独过表达*aspa*或*aspc*，以及两者组合过表达均能提高产量，其中组合过表达效果最佳（菌株C13）。敲除*iclr*（菌株C14）进一步将产量提升至1.72 g/L，暗示了乙醛酸循环对前体供应的贡献。优化*aspa*拷贝数后，拥有三个拷贝的菌株达到了此阶段最高产量1.91 g/L。在增强草酰乙酸供应的对比实验中，过表达*ppc*和引入*pyc*均能显著提高产量（分别提高47.9%和52.5%），且引入*pyc*的策略略胜一筹，表明在特定背景下，这条外源途径可能具有更高的催化效率或更少的代谢干扰。
第四，在辅因子工程阶段， 敲除*amn*（菌株C20）和过表达*pntAB*（菌株C21）均能进一步提升四氢嘧啶产量和生物量，其中*pntAB*过表达效果更显著（产量提高15%）。对细胞内NADPH和ATP水平的分析（以单位细胞干重计）证实，工程化改造后的菌株C21，其ATP水平相较于未进行辅因子工程的菌株有显著提升。这直接说明，在强化了多个前体合成模块后，辅因子供应确实成为了新的限制瓶颈，而针对性的工程干预能有效缓解这一瓶颈。
最终，在组合优化与放大验证阶段， 将各个模块的最优策略逐步叠加，工程菌株的产量在摇瓶中呈现阶梯式增长，最终菌株C24的产量达到5.65 g/L，比C21提高了14.4%。在5升发酵罐的补料分批发酵中，C24菌株展现了强大的生产能力。发酵过程持续约70小时，最大菌体密度OD600达到65。在进入稳定期并诱导后，四氢嘧啶开始快速积累。发酵结束时，四氢嘧啶浓度高达35.33 g/L，葡萄糖转化率为0.21 g/g，生产率达到0.49 g/(L·h)。这一产量在已报道的利用大肠杆菌生产四氢嘧啶的研究中处于先进水平。
结论与意义
本研究成功通过系统性的代谢工程改造，将大肠杆菌BL21(DE3)改造为一个高效的四氢嘧啶细胞工厂。研究得出明确结论：1）采用高拷贝质粒表达原始的*ectABC*基因簇是有效的启动策略；2）截断*thrA*并敲除*lysA*能够有效引导代谢流向目标产物；3）天冬氨酸激酶（ThrA*）和天冬氨酸酶（AspA）的拷贝数需要精细优化以获得最佳效果，本研究中分别为3个拷贝；4）引入谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶（Pyc）是增强草酰乙酸供应的有效策略；5）辅因子工程（增强ATP和NADPH供应）是进一步提升高产菌株性能的关键步骤；6）通过模块化、组合式的工程策略，可以协同提升四氢嘧啶的合成能力，最终工程菌株C24在5升发酵罐中实现了35.33 g/L的高产量。
本研究的科学价值在于，它提供了一个在大肠杆菌中系统优化复杂天然产物异源合成途径的完整范例。研究不仅应用了传统的基因过表达和敲除技术，还综合运用了基因截短、拷贝数优化、外源途径引入、辅因子平衡等多种代谢工程策略，并详细阐述了各模块的贡献与相互作用，揭示了从初级代谢到产物合成途径中的多重限速步骤及其解决方案。其应用价值则更为直接和显著：所构建的工程菌株CIV产量高、发酵工艺不依赖高盐环境，为四氢嘧啶的大规模、低成本工业化生物制造奠定了坚实的菌种基础，有望替代传统的嗜盐菌生产工艺，降低设备腐蚀和环保压力，促进四氢嘧啶在化妆品、医药和食品等领域的更广泛应用。
研究亮点
其他有价值的内容
论文在讨论部分对比了本研究结果与近年来其他利用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌生产四氢嘧啶的文献（见原文表2），将C24菌株的产量置于领域发展脉络中进行定位，显示了其竞争优势。同时，作者也客观指出了当前产量（0.21 g/g葡萄糖）与理论最大产量（0.63 g/g）之间仍存在差距，并基于对发酵副产物（主要是乙酸和乳酸）的分析，提出了未来的改进方向：包括进一步弱化副酸合成途径，以及结合转录组学、代谢组学和人工智能技术对合成网络进行更精确的整体调控，并探索通过多阶段发酵策略来优化工艺。这些思考为后续研究指明了有价值的切入点。