学术研究报告：基于优化自转运蛋白的MATE系统在大肠杆菌中实现重组蛋白表面展示与分泌
一、 研究团队与发表信息
本研究由德国明斯特大学（Westphalian Wilhelms-University, Münster）药物与药物化学研究所（Institute of Pharmaceutical and Medicinal Chemistry）的Shanna Sichwart、Iasson E.P. Tozakidis、Mark Teese和Joachim Jose*（通讯作者）合作完成。研究论文题为“Maximized Autotransporter-mediated Expression (MATE) for Surface Display and Secretion of Recombinant Proteins in Escherichia coli”，发表于食品技术与生物技术领域的学术期刊《Food Technology and Biotechnology》2015年第53卷第3期，具体页码为251-260。论文于2014年7月8日收到，2015年3月27日被接受。
二、 研究背景与目标
本研究的科学领域属于微生物工程与蛋白质工程，具体聚焦于革兰氏阴性细菌（以大肠杆菌Escherichia coli为代表）的蛋白质分泌与表面展示技术。
研究背景： 在生物技术和生物制造中，将目标蛋白表达于细胞表面或分泌到胞外培养基中，相较于传统的细胞内表达具有显著优势。表面展示的蛋白易于进行结合研究或酶活测定，且细胞附着形式的蛋白通常比溶液中的更稳定，类似于固定在基质上的效果。而将目标蛋白分泌到细胞外，则可以避免繁琐、耗时的蛋白纯化步骤，通过简单的离心即可去除细胞，极大地简化了下游工艺。然而，大肠杆菌本身并不擅长高水平分泌蛋白质，这反而使其成为分泌表达的理想宿主，因为分泌的目标蛋白可以很容易地从成分相对简单的培养基背景中分离出来。
革兰氏阴性菌具有复杂的双层膜结构，其蛋白分泌系统多样。自转运蛋白（Autotransporter）途径，也称为Va型分泌系统，是其中一种简单且广泛存在的机制，用于将蛋白质转运穿过细胞包膜。典型的自转运蛋白包含四个部分：N端信号肽（引导穿越内膜）、乘客结构域（Passenger domain，即被转运的目标蛋白）、连接区（Linker）和C端的β-桶状结构域（β-barrel domain，插入外膜形成孔道）。通过将天然乘客结构域的编码序列替换为目标蛋白的序列，即可利用该机制实现重组蛋白的表面展示。此外，通过在内源性宿主蛋白酶（如外膜蛋白酶Ompt）切割位点或自切割机制，乘客结构域可以从细胞表面释放，实现分泌表达。然而，此前基于Aida-I等自转运蛋白的系统，在利用Ompt实现大规模制备性蛋白分泌方面效果有限。
研究目标： 本研究旨在开发一个新型的、优化的自转运蛋白介导的表达系统，命名为MATE（Maximized Autotransporter-mediated Expression）。该系统的主要目标是创建一个通用型工具，能够根据所使用的宿主菌株（Ompt蛋白酶阳性或阴性），灵活地用于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表面展示或连续分泌。研究者希望该系统能克服以往系统的局限，实现使用单一质粒，通过简单更换宿主菌株，即可在表面展示（用于筛选）和分泌生产（用于纯化）两种模式间切换，并能够获得足够用于制备和分析的分泌蛋白产量。
三、 研究流程与方法细节
本研究包含多个相互关联的实验流程，从系统设计构建到功能验证，逻辑清晰。
1. MATE系统的设计与质粒构建： 研究者设计并合成了一个名为MATE的人工基因。该基因构建体包含以下关键组件（从N端到C端）： * 启动子： IPTG诱导的T5启动子，用于控制表达。 * 信号肽： 霍乱毒素B亚基（CTxB）的信号肽序列，用于引导蛋白质穿越细菌内膜。 * 多克隆位点（MCS）： 用于插入目标乘客蛋白基因。 * 蛋白酶切割位点与标签： 在多克隆位点两侧，设计了用于纯化（6xHis标签）和检测的线性表位，并特意插入了Factor Xa蛋白酶和Ompt蛋白酶的切割位点。其中，人工引入的Ompt切割位点（Ala-Arg-Arg-Ala）是实现可控分泌的关键。 * 自转运蛋白结构域： 采用来自大肠杆菌O157:H7的Ehaa自转运蛋白的C端部分（连接区和β-桶状结构域），并对其DNA序列进行了密码子优化，以适应大肠杆菌在生理压力下的密码子使用偏好，从而提高表达效率。这是“最大化表达”策略的一部分。 * 载体骨架： 基于pJExpress-401载体，包含Kan抗性基因、lacI阻遏蛋白基因等。
首先，构建了基础质粒pMATE-MT004，其乘客结构域是一个简单的6xHis标签。随后，通过分子克隆技术（In-Fusion®技术），将红色荧光蛋白mCherry的基因和来自Burkholderia gladioli的酯酶EstA的基因分别插入多克隆位点，构建了pMATE-SI015（表达MATE-mCherry融合蛋白）和pMATE-PT013（表达MATE-EstA融合蛋白）。作为对比，还构建了基于Aida-I自转运蛋白结构域的pAIDAI-PT014（表达AIDAI-mCherry）。所有构建均通过限制性酶切分析和DNA测序验证。
2. 系统功能验证：表面展示 * 研究材料： 使用Ompt蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株（如UT5600、BL21）进行表面展示实验，以避免乘客蛋白被切割释放。 * 实验方法： * 细胞分馏与Western Blot： 将携带不同质粒的菌株培养至对数中期，用IPTG诱导表达。通过差速离心和去垢剂处理分离外膜蛋白组分，进行SDS-PAGE和Western Blot分析（使用抗6xHis抗体），以验证融合蛋白是否成功定位到外膜。 * 流式细胞术： 用于验证蛋白在活细胞表面的功能性展示。对于表达MATE-mCherry的细胞，使用抗6xHis一抗和DyLight 633标记的二抗进行染色。由于抗体无法穿透外膜，只有当6xHis表位（位于mCherry的N端）暴露在细胞表面时，才能检测到荧光信号。同时，直接检测mCherry自身荧光，以确认其正确折叠。 * 酶活测定： 对于展示EstA酯酶的细胞，以其底物对硝基苯乙酸酯（pNPA）进行活性测定，通过监测405 nm处对硝基苯酚释放引起的吸光度增加，来验证表面展示的酶是否具有催化活性。
3. 系统功能验证：蛋白分泌 * 研究材料： 使用Ompt蛋白酶阳性的大肠杆菌菌株UT2300进行分泌实验。 * 实验方法： * 蛋白酶活性测定： 采用基于荧光共振能量转移（FRET）的方法，使用合成肽底物ABZ-Ala-Arg-Arg-Ala-Tyr(NO2)-NH2，定量比较UT2300（Ompt+）和UT5600（Ompt-）菌株的全细胞或外膜制备物中的Ompt蛋白酶活性，确认UT2300具有切割人工位点的能力。 * 蛋白分泌与纯化： 将携带pMATE-SI015（编码MATE-mCherry）的UT2300和UT5600菌株在LB培养基中大规模培养（800 ml），IPTG诱导后继续培养24小时。离心去除细胞，将无细胞上清液过滤后，通过镍柱亲和层析（IMAC）纯化分泌出来的带6xHis标签的mCherry。通过测量280 nm吸光度和Bradford法测定蛋白浓度，计算分泌产量。 * 分泌产物表征： 对纯化的蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot分析，并测量其荧光发射光谱（激发光550 nm，记录580-700 nm发射光谱），以确认分泌的mCherry具有正确的分子量和荧光特性。
4. 效率分析与比较 * 实验方法： 对表达MATE-mCherry的UT2300和UT5600菌株进行系统的细胞分馏，分别获取可溶性蛋白、外膜蛋白和分泌到培养基中的蛋白。通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western Blot，结合ImageJ软件对条带强度进行半定量分析，比较融合蛋白在不同组分中的分布比例，从而评估系统的转运效率和Ompt介导的切割/分泌效率。同时，比较MATE系统与基于Aida-I的系统在外膜定位融合蛋白的量上的差异。
四、 主要研究结果
1. MATE系统支持多种蛋白的有效表面展示： * Western Blot和SDS-PAGE结果显示，无论是携带小肽（6xHis）、mCherry还是EstA的MATE融合蛋白，在Ompt阴性菌株中都能成功定位到细菌外膜。其中，携带较大乘客蛋白（mCherry, EstA）的融合蛋白在外膜中的检测量甚至高于仅携带6xHis标签的融合蛋白，表明转运效率可能受乘客蛋白序列本身特性影响，而非单纯由其长度决定。 * 流式细胞术结果明确显示，在Ompt阴性菌株UT5600中，表达MATE-mCherry的细胞其抗6xHis抗体染色信号（DyLight 633荧光）显著高于空载体对照，证实mCherry的N端确实暴露于细胞表面。同时，这些细胞也显示出强烈的mCherry自身红色荧光，证明表面展示的mCherry正确折叠并具有功能。 * 酶活测定结果表明，表面展示EstA酯酶的细胞能够有效水解底物pNPA，催化活性显著高于展示mCherry或携带空载体的对照细胞，证明MATE系统展示的酶具有生物学活性。
2. MATE系统支持基于Ompt的连续蛋白分泌： * 蛋白酶活性测定证实，UT2300菌株具有可检测的Ompt活性，能够切割人工引入的Ala-Arg-Arg-Ala位点。 * 分泌与纯化实验取得了关键成功：当在Ompt阳性菌株UT2300中表达MATE-mCherry时，能够在培养上清中纯化出具有特征性粉红色的mCherry蛋白。产量为从800 ml培养上清中获得约240 μg纯化蛋白（约0.3 mg/L）。纯化蛋白的荧光发射光谱峰值在615 nm左右，与标准mCherry一致。SDS-PAGE和Western Blot显示一条约30 kDa的条带，与预测的切除信号肽和Ompt切割后释放的6xHis-mCherry分子量（28.4 kDa）相符。而在Ompt阴性菌株UT5600的对照实验中，无法从上清中纯化出可见的mCherry。 * 重要发现： 分泌的mCherry产物中没有出现更小的降解条带，这表明Ompt蛋白酶只特异性切割了人工引入的位点，而没有攻击mCherry蛋白内部本身存在的潜在切割位点（如Arg-Arg）。这可能是由于mCherry在接触到Ompt之前已经正确折叠，使其内部的位点无法被蛋白酶接近。
3. MATE系统具有高效的转运效率和一定的分泌效率： * 细胞分馏分析表明，在UT2300和UT5600菌株中，绝大部分表达的MATE-mCherry融合蛋白都位于外膜组分中，可溶性组分中几乎检测不到。这证明MATE系统将融合蛋白转运并整合到大肠杆菌外膜的效率非常高。 * 半定量比较外膜中的融合蛋白（MATE-mCherry）条带与分泌上清中的游离mCherry条带强度发现，在Ompt阳性的UT2300中，只有一部分（研究者估算约45%）的外膜锚定蛋白被切割并释放到培养基中。这表明，限制分泌产量的主要瓶颈是宿主菌内源Ompt蛋白酶的活性，而非MATE系统本身的表达或转运能力。与之前报道的基于SPATE（具有自切割活性）的自转运系统相比，MATE系统的产量（0.3 mg/L）低于某些SPATE系统（约1 mg/L），这很可能就是由于依赖内源Ompt活性的限制。
4. MATE系统相较于Aida-I系统的优势： SDS-PAGE结果显示，使用相同乘客蛋白（mCherry）时，基于Ehaa的MATE系统在外膜中积累的融合蛋白量明显高于基于Aida-I的系统。这表明经过密码子优化的Ehaa自转运蛋白结构域可能具有更高的表达或转运效率。
五、 研究结论与价值
本研究成功开发并验证了一种名为MATE的新型最大化自转运蛋白介导表达系统。该系统基于经过密码子优化的大肠杆菌Ehaa自转运蛋白的C端结构域，并整合了人工Ompt蛋白酶切割位点。
核心结论： 1. 双功能性与灵活性： MATE系统是一个通用型工具，能够实现重组蛋白在大肠杆菌中的高效表面展示和可控分泌。其独特优势在于，仅通过将同一个质粒在Ompt阴性（如UT5600）和Ompt阳性（如UT2300）菌株间转移，即可分别在“表面展示模式”和“分泌生产模式”下运行。 2. 高效性： 系统能有效将不同大小和功能的乘客蛋白（小肽、荧光蛋白、酶）转运至细胞表面，并保持其正确折叠和生物活性。 3. 实用性： 系统首次证明，利用大肠杆菌内源的Ompt蛋白酶活性，可以实现正确折叠目标蛋白的连续分泌，并获得可用于制备性目的的蛋白量（本研究中为240 μg/800 ml培养物）。 4. 特异性： 人工引入的Ompt切割位点能被有效利用，且Ompt不会非特异性切割折叠好的乘客蛋白内部。
科学价值与应用价值： * 科学价值： 深化了对自转运蛋白机制应用的理解，特别是如何通过工程化改造（引入特异性蛋白酶位点、优化自转运蛋白结构域）来实现对蛋白定位（表面锚定vs.分泌）的精确控制。为研究蛋白质分泌、膜蛋白整合及宿主-蛋白相互作用提供了有力工具。 * 应用价值： * 生物技术平台： 为蛋白工程和高通量筛选提供了一个高效的一体化平台。研究人员可以先利用表面展示模式在Ompt阴性菌中筛选具有特定性质（如更高亲和力、更强酶活）的蛋白变体库，然后只需将筛选出的最优质粒转入Ompt阳性菌，即可直接进行该变体蛋白的分泌表达和纯化，极大简化了从筛选到生产的流程。 * 重组蛋白生产： 为难以在大肠杆菌胞内可溶性表达或纯化复杂的蛋白提供了一种替代生产策略。分泌表达简化了下游纯化，减少了宿主蛋白污染。 * 全细胞催化剂与生物传感器： 表面展示功能酶（如EstA）的细胞可直接作为全细胞催化剂；展示受体或抗体的细胞可用于生物检测或吸附。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还对Ehaa自转运蛋白进行了生物信息学分析，将其归类于自转运蛋白家族中的特定亚组（与IcsA/VirG亚家族更近），并指出Ehaa样序列存在于多种革兰氏阴性菌中，暗示MATE系统的核心组件（Ehaa结构域）可能具有在更广泛宿主中应用的潜力。此外，研究验证了人工Ompt切割位点的有效性，并排除了其对折叠蛋白内部潜在位点的非靶向切割，增加了系统的可靠性和可预测性。最后，作者在讨论中提出了未来通过过表达Ompt蛋白酶来进一步提升分泌产量的可能性，为系统的优化留下了清晰的路径。