在低磷胁迫下，铁动员诱导CLE14表达并通过CLV2/PEPR2信号通路触发根尖分生组织分化

主要作者及发表信息

本研究由来自墨西哥国家理工学院高级研究中心（Cinvestav）所的Dolores Gutiérrez-Alanís、Lenin Yong-Villalobos、Pedro Jiménez-Sandoval、Fulgencio Alatorre-Cobos、Araceli Oropeza-Aburto、Javier Mora-Macías，以及墨西哥国立自治大学生物技术研究所的Federico Sánchez-Rodríguez、Alfredo Cruz-Ramírez和Luis Herrera-Estrella共同完成。Luis Herrera-Estrella为本文的通讯作者。该研究于2017年6月5日发表在学术期刊《Developmental Cell》第41卷，页码为555至570。

学术背景

磷是植物生长发育所必需的大量营养元素，其可用性是限制自然和农业生态系统中植物生产力的关键因素。在模式植物拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中，为了应对无机磷酸盐（inorganic phosphate, Pi）的匮乏，植物会启动一系列适应性策略，其中最为显著的便是根系统构型的改变，具体表现为侧根增多、根毛伸长、主根生长受到抑制，以及根尖分生组织（Root Apical Meristem, RAM）中所有细胞的末端分化，这一现象被称为根尖分生组织耗竭或有限生长。尽管该现象已被发现，但根尖分生组织如何感知并适应低磷环境的分子机制尚不清晰。

此前的研究已证实，LPR1（Low Phosphate Root 1）和LPR2铁氧化酶以及PDR2（Phosphate Deficiency Response 2）是根尖分生组织响应磷可用性的关键组分。在低磷条件下，LPR1-PDR2模块决定铁在根尖的积累位点，引起胼胝质沉积，干扰胞间通讯，进而阻碍关键转录因子SHR（SHORT ROOT）的移动，最终导致根尖分生组织分化。但其中是否存在其他信号分子，尤其是多肽信号的参与，是领域内亟待探索的问题。本研究旨在揭示磷饥饿信号传导中一个全新的分子参与者——CLE14多肽，并系统阐明其作用机制。

研究工作流程、实验方法与结果

本研究的实验工作流程清晰，层层递进，可分为五个主要阶段，每个阶段都基于前序发现，共同构建了一个完整的信号传导模型。

第一阶段：鉴定并验证CLE14是响应低磷胁迫的关键多肽。 研究人员首先基于此前在日本百脉根中的研究，对拟南芥根尖中表达的10个CLE（CLAVATA3/ESR）基因家族成员进行转录组分析。他们将野生型（Col-0）拟南芥幼苗在含1 mM Pi（+Pi）或无Pi（-Pi）的培养基中生长，提取根尖RNA进行定量PCR（qRT-PCR）分析。结果显示，在磷饥饿24小时后，仅有*CLE14*、*CLE22*和*CLE26*三个基因的转录水平上调，而*CLE14*的诱导尤为受到关注，因为它在*LPI4*（Low Phosphorus Insensitive 4）突变体（其根尖在低磷下不发生分化）的转录组谱中表达下调。 为了精确解析*CLE14*的时空表达模式，研究者构建了*CLE14*启动子驱动的GFP报告株系（pCLE14::GFP）以及*CLE14*自身的翻译融合株系（pCLE14::CLE14-GFP），进行了详尽的显微观察和转录水平验证。在+Pi条件下，GFP信号仅限于根冠和侧根冠细胞。转移至-Pi条件24小时后，GFP表达扩展至皮层、内皮层、中柱以及皮层/内皮层起始子细胞。48小时后，表达范围进一步扩大。长期培养观察（4-12天）表明，GFP信号强度随低磷处理时间逐渐增强，并与根尖分生组织的渐进式分化程度高度相关，在12天时，随着根尖分化完全，GFP信号显著下降。qRT-PCR结果也证实*CLE14*转录本水平在低磷下呈时间依赖性增加。此外，研究还排除了其他非生物胁迫，证实*CLE14*的表达上调是磷饥饿特异性响应。

第二阶段：证明CLE14作用于LPR1/LPR2铁氧化酶的下游。 为了建立*CLE14*与已知的磷感知途径的关系，研究人员进行了遗传学和药理学实验。他们比较了野生型（WT）、*lpr1-1*和*lpr1 lpr2*双突变体在+Pi、-Pi以及与添加合成CLE14多肽的+Pi培养基（+Pi + CLE14）中的根尖表型。在-Pi条件下，100%的野生型幼苗在12天时根尖全部分化，而*lpr1 lpr2*双突变体即使在20天后依然保持了完整的根尖分生组织，*lpr1-1*突变体则仅70%在20天时完全分化。然而，在+Pi + CLE14培养基中，所有基因型，包括*lpr1 lpr2*双突变体的根尖分生组织均在20天时完全分化，表明外源CLE14可以绕过*LPR1/LPR2*的功能缺失，直接触发根尖分化。进一步的定量PCR证实*CLE14*在*lpr1 lpr2*突变体- Pi条件下的表达水平比野生型低62%，且GFP报告信号在该突变体背景中消失。这些结果强有力地证明*CLE14*遗传学上位于*LPR1/LPR2*的下游。 研究者接着分析了CLE14功能是否依赖LPR1/LPR2下游已知的胼胝质沉积途径。苯胺蓝染色结果显示，外源CLE14多肽在诱导*lpr1 lpr2*根尖完全分化的同时，并未引起任何胼胝质沉积。这揭示了一个重要的新机制：CLE14触发根尖分化的过程可以独立于胼胝质沉积。

第三阶段：揭示低磷胁迫下铁在根尖的重新分布是诱导CLE14表达的必要条件。 鉴于LPR1/LPR2参与铁转运，研究者探索了铁在*CLE14*表达调控中的作用。他们发现，在同时缺乏Pi和Fe（-Pi -Fe）的培养基中，pCLE14::GFP的表达未被诱导，且即使在12天后根尖也未分化。而在仅缺Pi的培养基中，铁的出现才激活了*CLE14*表达和根尖分化。通过Perls/DAB和Turnbull/DAB组织化学染色，他们直观地展示了铁在根尖的分布动态：+Pi条件下，铁主要积聚在静止中心（Quiescent Center, QC）和根冠中；而在-Pi条件下，铁明显从静止中心和根冠中耗竭，并重新分布至皮层、内皮层和中柱的过渡扩增细胞区域。这种由低磷引起的特异性的铁分布模式，在空间和时间上均与*CLE14*的诱导表达高度重叠。与其它抑制根生长的条件（如外源高铁或百草枯处理）对比，仅磷饥饿导致的特定铁重新分布模式才能激活*CLE14*的表达，证实该过程需要磷饥饿背景下的铁感知，而非铁本身或生长抑制的作用。

第四阶段：阐明CLE14通过CLV2和PEPR2受体传递信号，触发根尖分化。 为了寻找感知CLE14信号的受体，研究者结合了遗传学、分子生物学和结构生物学方法。他们观察了多个受体突变体如*clv2-3*、*clv2 sol2*、*pepr2-1*以及*clv2 pepr2*双突变体在-Pi和+Pi + CLE14条件下的表型。结果表明，仅*clv2 pepr2*双突变体在-Pi条件下14天仍维持不分化根尖，对外源CLE14多肽处理也完全无响应，而单突变体*clv2-3*和*clv2 sol2*虽对外源CLE14不敏感，但在-Pi下却发生分化。进一步分析发现，*PEPR2*基因的转录本在磷饥饿的野生型根尖中上调，而其启动子报告基因（pPEPR2::GUS）活性也在根尖分生组织中增强。这表明在正常条件下主要由CLV2/SOL2复合体感知过量CLE14，而在低磷诱导下，PEPR2的表达被激活，与CLV2协同作用，共同感知内源性升高的CLE14信号。计算机分子对接模型完美预测了CLE14多肽能与CLV2和PEPR2的胞外域稳定结合，双分子荧光互补（BiFC）实验在活体拟南芥根胞中证实了这两对蛋白之间的直接互作。

第五阶段：确认CLE14是SHR/SCR和PIN/生长素通路的上游负调控因子。 研究者最后探讨了CLE14信号下游的靶标。通过分析pSHR::SHR-GFP和pSCR::SCR-GFP报告株系，他们发现低磷处理48小时后，即在任何明显的形态学变化发生前，SHR和SCR的蛋白表达与分布就已受到干扰。而外源添加CLE14多肽也能在+Pi条件下显著抑制这些标记基因在根尖干细胞巢（Root Stem Cell Niche, RSCN）中的表达，并导致原本应发生不对称分裂产生皮层和内皮层两层组织的皮层/内皮层起始子细胞（CEID）分裂失败，产生一个类似于*shr*或*scr*突变体的单层地面组织表型。此外，静止中心标记基因*pWOX5::GFP*在低磷或外源CLE14处理下表达也显著下降。同时，外源CLE14处理还显著降低了生长素报告基因pDR5::GFP的强度，并抑制了PIN1、PIN2、PIN3蛋白的丰度和极性分布。这些结果表明，CLE14信号通路整合性地抑制了维持根尖干细胞巢的两大核心通路——SHR/SCR转录因子复合体和PIN介导的生长素极性运输，从而驱动根尖分生组织的终端分化。

结论与价值

本研究首次鉴定CLE14多肽是拟南芥根系响应磷饥饿、导致根尖分生组织完全分化的关键内源信号分子。研究完整地勾勒出一条从“磷感知”到“发育调整”的分子通路：低磷胁迫通过LPR1/LPR2铁氧化酶引发根尖特异性铁重新分布，从而在空间上精确诱导*CLE14*在过渡扩增区细胞中表达；分泌的CLE14多肽被CLV2和PEPR2受体协同感知，进而向下游传递信号，通过负调控SHR/SCR和PIN/生长素这两条维持干细胞命运的核心通路，最终不可逆地驱动根尖分生组织耗竭与末端分化。其科学价值在于解锁了植物营养胁迫响应与干细胞稳态调控之间直接通过多肽信号耦联的新机制，为理解植物发育可塑性提供了一个极佳的范例，并为未来通过精准调控根构型以提升作物磷吸收效率提供了潜在的新靶标。

研究亮点

本研究的一大亮点在于发现了CLE14独立于胼胝质沉积的新型根尖分化诱导机制。此前观点认为LPR1介导的胼胝质沉积是阻碍SHR移动从而引致分化的直接原因，而本研究发现CLE14可直接通过受体信号转导抑制SHR和SCR的转录表达，修正并深化了对这一过程的理解。其次，研究发现传统上参与防御反应的受体激酶PEPR2在低磷胁迫下被重新征用，与经典的发育调控受体CLV2协同感知同一多肽信号，共同调控发育过程，这彰显了植物在进化中利用同一信号模块响应不同外界刺激的精妙策略。此外，研究综合运用了精巧的转录和翻译报告株系、组织特异性异位表达系统、基因突变体遗传解析、药理学添加、计算机模拟和活体互作检测等多种手段，逻辑层层递进，为后续类似研究提供了方法学参考。